張松達(dá)

（青海省第四人民醫(yī)院藥械科，青海 西寧 810000）

淺談止血藥凝血酶的研究進(jìn)展

張松達(dá)

（青海省第四人民醫(yī)院藥械科，青海 西寧 810000）

凝血酶是機(jī)體凝血系統(tǒng)中的天然成分，是一種生成于損傷處血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能蛋白酶，它是參與凝血過(guò)程各個(gè)環(huán)節(jié)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶。本文介紹了凝血酶的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、在體內(nèi)凝血機(jī)制中的作用及臨床應(yīng)用，并分析了其作為一種重要的外傷止血藥的生產(chǎn)現(xiàn)狀和前景。

止血藥凝血酶；凝血機(jī)制；凝血酶原

止血藥廣泛用于臨床各科，如內(nèi)科、外科、婦產(chǎn)科、五官科、燒傷科等。但血液的凝固（凝血）過(guò)程是由許多凝血因子參與的復(fù)雜的酶反應(yīng)，最終產(chǎn)生不溶解的緊密穩(wěn)定的纖維蛋白多聚體，一般有如下3個(gè)階段:第一階段為凝血酶原激活物的形成，包括內(nèi)源性和外源性兩條途徑；第二階段為凝血酶原激活物催化凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟?；第三階段為凝血酶催化纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，形成凍膠狀血塊。

1939年，美國(guó)學(xué)者Seegers 等人首次從血清中成功地分離出凝血酶，并應(yīng)用于臨床，對(duì)肝臟實(shí)質(zhì)性出血和骨髓出血的止血取得了明顯效果。隨后Rogers將凝血酶用于消化道亦獲得確切療效。1944年相繼有人用凝血酶進(jìn)行手術(shù)創(chuàng)面的止血，均獲得明顯效果，美國(guó)藥典于1950年開(kāi)始收載此藥，繼而英國(guó)藥典，日本藥局方（日本藥典）等亦予收載。自80年代末以來(lái)，國(guó)內(nèi)廠家相繼開(kāi)發(fā)成功，并廣泛用于臨床各科。中國(guó)藥典委員會(huì)和衛(wèi)生部于1993年12月頒布了“凝血酶”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（93）衛(wèi)藥標(biāo)字03號(hào)，并規(guī)定從1994年1月1日起執(zhí)行。同時(shí)廢止該藥的所有地方標(biāo)準(zhǔn)。《中華人民共和國(guó)藥典》1995年版第二部已收載該藥。

權(quán)所1 止血藥市場(chǎng)潛力巨大

止血藥是通過(guò)收縮小動(dòng)脈及毛細(xì)血管，或增強(qiáng)血小板功能，或加速、加強(qiáng)血液凝固過(guò)程，或抑制血塊溶解過(guò)程而產(chǎn)生止血作用。目前國(guó)內(nèi)臨床常用的止血藥約有20多種，根據(jù)作用于凝血機(jī)制的不同環(huán)節(jié)，分為四大類。①促凝血因子活性藥：代表藥物有血凝酶、去氨加壓素、維生素K1、維生素K3、維生素K4、甘氨酸乙二胺等。②降低毛細(xì)血管通透性藥：代表藥物有卡巴克絡(luò)、卡絡(luò)磺鈉。③抗纖維蛋白溶解藥：代表藥物有氨基己酸、氨甲苯酸、氨甲環(huán)酸、抑肽酶等。④其他外用止血藥：有可吸收創(chuàng)面的止血封固劑、明膠海綿、吸收性止血綾、小蘗胺、云南白藥、止血粉8號(hào)、止血消炎貼等。

有資料顯示，目前我國(guó)每年需治療出血的患者總數(shù)大約有900多萬(wàn)人以上，主要集中在手術(shù)科室以及部分內(nèi)科科室，在多種止血方法中，止血藥被廣泛使用。由于止血藥的止血特性在臨床上屬于必用產(chǎn)品，且無(wú)可替代，因此在臨床上使用的順應(yīng)性非常強(qiáng)。據(jù)中國(guó)藥學(xué)會(huì)最新公布的2005年上半年全國(guó)16個(gè)重點(diǎn)城市典型醫(yī)院止血藥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，凝血酶類藥物在止血藥市場(chǎng)中份額高達(dá)60%。

2 凝血酶的藥理作用

2.1 凝血酶作為凝血因子Ⅱa，可不需經(jīng)過(guò)血液凝固的第一、第二階段而直接作用于纖維蛋白原，使之轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，使血液快速凝固、填塞出血點(diǎn)而達(dá)到止血的目的。因其作用于止血的最后環(huán)節(jié)，故不需其他眾多因子的參與。

2.2 激活凝血因子Ⅶ，后者可使溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)殡y溶性纖維蛋白，形成凝血塊。

2.3 增強(qiáng)凝血因子X(jué)Ⅲ和V的活性，后者在Ca2+和凝脂參與下促進(jìn)凝血酶因子X(jué)a形成，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮?/p>

2.4 促進(jìn)血小板發(fā)生不可逆的聚集和血小板釋放效應(yīng)，加速血液凝固。

2.5 促進(jìn)上皮細(xì)胞生成，減少創(chuàng)面滲出，可使創(chuàng)面愈合時(shí)間縮短約一半。

3 凝血酶的生產(chǎn)現(xiàn)狀

目前國(guó)內(nèi)外主要從動(dòng)物血漿中及人血漿中制備凝血酶原，凝血酶原（prothrom bin） 即凝血因子Ⅱ是最早被提純和測(cè)定氨基酸序列的凝血因子。它是單鏈糖蛋白，在正常人血漿中的濃度為150～200mg/ L。凝血酶原屬于依賴維生素K的凝血因子。在血液凝固過(guò)程中，凝血酶原被磷脂膜表面形成的因子xa、因子va 復(fù)合物（凝血酶原復(fù)合物；prothrom bin asecomplex）激活而轉(zhuǎn)變?yōu)槟?，從而在凝血共同途徑中發(fā)揮重要作用。

從動(dòng)物血漿中及人血漿中制備凝血酶原，再經(jīng)激活物激活而成為凝血酶。它可直接催化血纖維蛋白原血纖維肽A和B的斷裂，轉(zhuǎn)變成不溶性血纖維蛋白凝塊。從血液中提取分離凝血酶，凝血酶原的激活是影響提取得率的關(guān)鍵步驟。其激活方式較多，一般采用凝血因子X(jué)a、凝血因子V、Ca2+和磷脂進(jìn)行激活、也有采用蛇毒、25%檸檬酸鈉、腦粉和肺提取液來(lái)進(jìn)行的。目前國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，酶原激活的最佳條件為：CaCl2濃度為1.0% ，時(shí)間為15min，溫度為37℃。且該工藝已應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)。此工藝形成凝血酶的過(guò)程比較復(fù)雜，凝血酶原先在Ca2+的作用下水解釋放出糖多肽，并轉(zhuǎn)換成中間產(chǎn)物II。此中間產(chǎn)物在Ca2+的作用下，肽鏈內(nèi)部裂解成凝血酶，而凝血酶又可自身催化凝血酶原變成中間產(chǎn)物I，中間產(chǎn)物I在Ca2+的作用下又轉(zhuǎn)變成中間產(chǎn)物II，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成凝血酶。

4 基因工程生產(chǎn)重組凝血酶的前景

從國(guó)外許多文獻(xiàn)報(bào)道可知，目前已有幾種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)用于表達(dá)凝血酶原和它的變異體。最終凝血酶產(chǎn)量大約在0.5～8υg每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液。但由于表達(dá)量較低的原因，目前還無(wú)法用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。另外也有用大腸桿菌表達(dá)凝血酶前體-2 （preth rombin-2）的報(bào)道，產(chǎn)量大約是每升細(xì)胞培養(yǎng)液能純化得8mg unfolded protein。

prethrom bin-2是一種較短的凝血酶單鏈前體，共有308個(gè)氨基酸殘基[1]。其在體內(nèi)受到凝血因子FXa的作用而激活，凝血因子FXa 有特異的識(shí)別序列，在FV，Ca2+，磷脂等凝血酶原復(fù)合物的共同參與下，可特異性的切開(kāi)prethrom bin-2 中的Arg-Ile。形成與有活性的凝血酶相同的空間結(jié)構(gòu)。

重組prothrom bin和prethrom bin-2則必需經(jīng)其他方式在體外進(jìn)行激活，目前研究較多的體外激活方法是借助于一些蛇毒的作用。由于蛇毒中含有許多活性因子成分，能作用于多種與凝血和抗凝血有關(guān)的蛋白和酶，因而能對(duì)機(jī)體的止血機(jī)制產(chǎn)生影響。國(guó)外已有許多研究肯定了蛇毒能激活prethrom bin-2，得到與天然蛋白活性一致的重組凝血酶[2]。

目前用于prethrom bin-2的應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)是E.coli. 選擇E.coli.做為表達(dá)載體的技術(shù)已成熟穩(wěn)定，操作具有較為簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也有其不足之處，主要體現(xiàn)在純化階段的操作較為麻煩。因?yàn)?，prethrom bin-2，在正常情況下可溶的真核系統(tǒng)的蛋白，在E.coli.的表達(dá)中卻往往形成不可溶的包涵體。因此，在純化時(shí)不得不進(jìn)行超聲波破碎等處理。另外，由于E.coli.不具備真核系統(tǒng)所特有的二硫鍵修飾作用，其所表達(dá)出的目的蛋白無(wú)法形成與天然蛋白一致的二硫鍵，以上操作，必將增加純化階段的工作和難度，并且，過(guò)多的步驟也必定會(huì)對(duì)目的蛋白的穩(wěn)定性和得率產(chǎn)生不利的影響。

盡管如此，雖然目前血液資源的綜合利用在不斷發(fā)展，但血液資源仍不是十分豐富，因此隨著研究的進(jìn)展，人們應(yīng)用細(xì)胞工程和基因工程的方法制備凝血酶，來(lái)取代傳統(tǒng)的生化提取，仍然在現(xiàn)代生物制藥產(chǎn)業(yè)中具有良好的前景。

[1] 羅華,梁瑛.凝血酶激活的纖溶抑制物: 新的凝血纖溶調(diào)控因子[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2003,23 (5):484-489.

[2] 欒菲菲,于龍勝.凝血酶的臨床應(yīng)用[J].山東醫(yī)藥工業(yè),1998, 17(3):31-32.

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1671-8194（2013）16-0098-02