康 凱郭 林*

（1 大連大學(xué)研究生，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨二科，遼寧 大連116001）

羊膜的臨床研究新進(jìn)展

康 凱1郭 林2*

（1 大連大學(xué)研究生，遼寧 大連 116001；2 大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨二科，遼寧 大連116001）

羊膜；臨床研究

自1910年，羊膜首次被用作皮膚移植物，目前其臨床基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究更是如火如荼。本文就羊膜組織的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，生物學(xué)特性，其制備、保存、應(yīng)用加以綜述。

1 羊膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

人羊膜（human Amniotic Membrane，HAM）是胎兒和母體之間的一層隔膜，其基底膜是全身最厚的膜結(jié)構(gòu)，透明、有韌性，不含血管、神經(jīng)和淋巴組織。由內(nèi)到外分為5層：上皮細(xì)胞層、基底層、致密層、纖維母細(xì)胞層、海綿層。其中上皮細(xì)胞合成和分泌基質(zhì)，維持膜成分的穩(wěn)定。其余各層都是以網(wǎng)狀纖維為主要成分，各種蛋白、多糖、細(xì)胞鑲嵌其中，基底層含有層粘連蛋白和硫肝糖蛋白[1]，致密層薄而致密，起支持和濾過作用。纖維母細(xì)胞層在這五層結(jié)構(gòu)中最厚，含有成纖維細(xì)胞，海綿層的特點(diǎn)是膠原纖維呈波浪狀。

2 羊膜的生物學(xué)活性劑其特殊的生理作用

羊膜中的膠原纖維形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)為細(xì)胞的粘附、爬行提供了支架，有利于上皮細(xì)胞的生長和擴(kuò)增，預(yù)防其凋亡[2]，另外羊膜合成和分泌的多種細(xì)胞因子和生物酶對上皮的增殖和分化有強(qiáng)有力的促進(jìn)作用[3]；羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種抗炎因子（白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑）、抗血管形成因子（如內(nèi)皮抑素前體蛋白）。同時(shí)其也可抑制胰蛋白酶，膠原酶的活性。從而抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展和新生血管的形成；羊膜中的某些成分通過基因水平的調(diào)控可以抑制轉(zhuǎn)化生長因子β的合成，從而抑制纖維母細(xì)胞的活性，減少瘢痕形成[4]，減少組織粘連；羊膜致密層網(wǎng)狀纖維排列緊密，能阻止細(xì)菌等微生物的侵襲，從而防止感染和避免水分的丟失。同時(shí)由于羊膜上皮細(xì)胞膜上不表達(dá)HLA-A、B、C和DR抗原[5-7]，從而始動(dòng)環(huán)節(jié)避免了異體移植可能帶來的免疫排斥反應(yīng)。而且羊膜還能抑制多種免疫細(xì)胞的遷移，進(jìn)一步移植了免疫反應(yīng)，尤其是細(xì)胞免疫[8]。

3 羊膜組織細(xì)胞的制備和保存方法

3.1 羊膜的制備

取新分娩的健康（HIV，乙型肝炎，丙型肝炎，梅毒等檢查陰性）剖宮產(chǎn)孕婦胎盤，鈍性分離羊膜，無菌生理鹽水反復(fù)沖洗，去除血凝塊等其他物質(zhì)。將人羊膜上皮細(xì)胞面朝向上，上皮面朝上置于含抗生素的（慶大霉素1000U/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）生理鹽水中浸泡30min后沖洗3遍，按一定規(guī)格修剪，平鋪于無菌的乙酸纖維素薄膜上，4℃下可以保存24h。整個(gè)過程要注意無菌條件下操作。

3.2 羊膜細(xì)胞外基質(zhì)（脫細(xì)胞羊膜）的制備

將新鮮羊膜用純甘油于4℃下脫水3次，每次24h。PBS 復(fù)水后用0.25%胰蛋白酶消化，并刮除殘存的細(xì)胞成分，顯微鏡下證實(shí)無細(xì)胞后，上皮面朝上平鋪于乙酸纖維薄膜紙上。

3.3 羊膜的保存：

羊膜的保存方法主要有四種：①DMEM/甘油深低溫保存法：將羊膜片放入滅菌DMEM/甘油液中（1∶1），在-80℃下，用中性硅玻璃瓶可以密閉保存6個(gè)月；②純甘油4℃保存法：將羊膜片用消毒純甘油浸泡24h，然后換純甘油瓶，4℃下可以保存30d；③無水酒精保存法：75%酒精浸泡24h后，換100%酒精密閉保存，4℃或室溫保存半年；④真空干燥保存法：將羊膜片放入羊膜容器中，低溫真空干燥1h，加蓋蠟封4℃保存。

4 羊膜的臨床應(yīng)用

羊膜作為一種天然的高分子生物材料，在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用研究中用途廣泛。1910年Davis首先成功地將胎膜用作皮膚替代材料。此后用羊膜作移植材料治療燒傷及潰瘍的皮膚創(chuàng)面取得成功；1995年，用凍存的羊膜重建兔眼角膜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了成功，之后羊膜的眼科應(yīng)用取得了突破性進(jìn)展，并逐漸擴(kuò)展到其他各科。

4.1 眼部疾病

①羊膜可用于瞼球粘連、結(jié)膜缺損及瘢痕化等眼表疾病導(dǎo)致的皮膚黏膜缺損，將羊膜貼附于創(chuàng)傷表面，可以有效防止角結(jié)膜溶解及角膜穿孔，防止局部粘連，降低免疫排斥反應(yīng)，抑制炎癥的進(jìn)展，從而加快角膜和結(jié)膜修復(fù)。②治療感染、化學(xué)燒傷、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的角膜潰瘍[9]和角膜上皮缺損是，用羊膜覆蓋潰瘍表面，療效確切，視力有所提高，可以改善患者的生活質(zhì)量。Gris等[10]在對角膜上皮缺損的患者實(shí)行角膜移植術(shù)，術(shù)后全部治愈，未發(fā)生角膜溶解、潰瘍等并發(fā)癥。③翼狀胬肉切除后尤其是復(fù)發(fā)性胬肉，植入羊膜可以明顯降低復(fù)發(fā)率[11]。④青光眼患者的眼內(nèi)壓升高，采用羊膜移植進(jìn)行濾過道的重建[12]，減少青光眼手術(shù)導(dǎo)致的瘢痕形成，有效緩解患者的疼痛和視力下降，同時(shí)可以減少了術(shù)后應(yīng)用5-Fu和MMC帶來的并發(fā)癥。

4.2 泌尿和生殖系統(tǒng)

尿道狹窄和大段輸尿管缺損一直是泌尿外科的一大難題。Koziak等[13]通過羊膜移植治療男性尿道狹窄和大段輸尿管缺損的療效確切，排尿功能恢復(fù)正常，遠(yuǎn)期效果佳，有效率可達(dá)80%以上，而且影像學(xué)結(jié)果顯示移植部位的尿道寬與正常部位；羊膜被用于治療先天性無陰道的患者，范雪梅等[14]對11例先天性無陰道患者實(shí)施陰道成形術(shù)，然后將羊膜覆蓋于再造的陰道腔內(nèi)，手術(shù)效果滿意，術(shù)后陰道壁為黏膜上皮組織所覆蓋。

4.3 修補(bǔ)硬腦膜缺損

凍干羊膜修補(bǔ)硬腦膜安全、有效。張念平等[15]在豚鼠顱頂部開窗，切除硬腦膜，缺損處用凍干羊膜修補(bǔ)。術(shù)后3個(gè)月后修補(bǔ)材料可被纖維結(jié)締組織取代，局部皮膚切口愈合良好，無感染、皮下積液、腦脊液漏等不良并發(fā)癥。

4.4 皮膚燒傷

人羊膜無毒副作用，無免疫排斥反應(yīng)，其作為敷料治療重度燒傷有保護(hù)創(chuàng)面，減少滲出，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、減少感染的作用。Mohammadi[16]等將人羊膜敷料治療燒傷患者，效果明顯優(yōu)于應(yīng)用抗生素治療的對照組。

4.5 脫細(xì)胞羊膜作為組織工程支架材料的應(yīng)用

組織工程應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理來研究、開發(fā)、制作組織結(jié)構(gòu)和功能替代物，人羊膜是一種天然的高分子生物材料，其作為組織工程支架材料廣泛應(yīng)用于多種人工器官，組織。在眼科，將角膜緣干細(xì)胞和羊膜支架共培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程角膜，然后回植于機(jī)體角膜緣，治療Stevens-Johnson綜合征急慢性期的炎性反應(yīng)，瘢痕化，修補(bǔ)角膜缺損[17]。此外以羊膜和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖，分化[18]，從而構(gòu)建組織工程視網(wǎng)膜。近年來，應(yīng)用羊膜負(fù)載尿路上皮細(xì)胞恢復(fù)狹窄或者缺損的尿路[19]；負(fù)載表皮或毛囊干細(xì)胞來修復(fù)皮膚創(chuàng)面[20]；負(fù)載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨損傷[21]等。

總之，羊膜的極低免疫性、特有的組織結(jié)構(gòu)、和良好的生物學(xué)作用、廣泛的用途是其倍受關(guān)注的前提。加之組織來源充足，取材便利，無重大的倫理學(xué)方面的爭議，都將使其在未來的臨床實(shí)踐更加突出，尤其是在組織工程支架方面的應(yīng)用。

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A

1671-8194（2013）30-0039-03

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