超聲靶向破壞微泡介導(dǎo)基因傳輸在心血管疾病中的研究進(jìn)展

劉陽春，李 浪

目前，基因治療在心血管疾病中的應(yīng)用日益廣泛，但如何實(shí)現(xiàn)基因的高效轉(zhuǎn)染一直備受關(guān)注。眾所周知，基因直接注入后易被血液中的酶快速降解，其治療作用不能通過裸露的基因?qū)崿F(xiàn)；而腺病毒可能成為基因發(fā)揮治療作用的有效載體[1]，其轉(zhuǎn)染率高，但因存在肝毒性、致癌、致畸等作用而難以推廣應(yīng)用；裸質(zhì)粒雖避免了上述不利影響，但轉(zhuǎn)染率低[2]。近年來，靶向超聲造影劑已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，不僅可用于病變組織的靶向分子顯像，也可與藥物或基因等偶聯(lián)，用于病變部位的靶向治療，是一種高效、安全、具有靶向性的非病毒基因傳輸技術(shù)[3]。本文就超聲靶向破壞微泡(UTMD)介導(dǎo)基因傳輸在心血管疾病中的研究進(jìn)展做一綜述。

1　基因治療心血管疾病的現(xiàn)狀

外源基因要到達(dá)靶組織發(fā)揮治療作用，需要具備如下條件：(1)外源基因進(jìn)入血循環(huán)后應(yīng)避免被免疫系統(tǒng)或DNA酶降解；(2)能透過內(nèi)膜屏障進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)；(3)避免被細(xì)胞體內(nèi)的溶酶體降解；(4)能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮基因治療作用。裸露的外源基因進(jìn)入血循環(huán)后可被血液中的酶快速降解，因此要實(shí)現(xiàn)基因的靶向傳輸需借助載體。目前，基因載體主要包括病毒類載體[4]和非病毒載體[5]。

病毒類載體主要來源于腺病毒相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒等，其中腺病毒[6]是應(yīng)用較為廣泛的病毒類基因傳輸載體，具有較高的基因轉(zhuǎn)染率。Suckau等[7]利用腺病毒及腺病毒相關(guān)病毒運(yùn)載干擾RNA，經(jīng)主動脈途徑注入心力衰竭大鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示RNAi可使心肌細(xì)胞內(nèi)受磷蛋白表達(dá)沉默，進(jìn)而改善心力衰竭大鼠的血流動力學(xué)，證實(shí)病毒類載體可增加外源基因在靶組織的轉(zhuǎn)染率而發(fā)揮治療作用。雖然存在上述優(yōu)點(diǎn)，但病毒類載體因存在潛在的肝毒性、致癌、致畸作用及免疫原性而難以推廣應(yīng)用[8-9]。非病毒類載體包括化學(xué)方法(如脂質(zhì)體法)和物理方法(如基因槍、電擊法等)。與病毒類載體相比，非病毒類載體避免了上述缺點(diǎn)，并可攜帶分子量較大的基因[10]。裸質(zhì)粒是其中應(yīng)用較多的一類，但易被血漿中的DNA酶降解，脂質(zhì)體聯(lián)合裸質(zhì)粒介導(dǎo)基因傳輸雖對裸質(zhì)粒起到了一定的保護(hù)作用，卻同樣存在轉(zhuǎn)染率較低的問題[11]。物理方法作為一種侵入性基因傳輸方法，雖可實(shí)現(xiàn)基因的傳輸，但會帶來不同程度的組織損傷[12]。因此如何實(shí)現(xiàn)基因安全、有效的傳輸一直備受關(guān)注。

2　UTMD介導(dǎo)基因傳輸?shù)睦碚摶A(chǔ)

UTMD是指攜帶藥物或基因的超聲微泡造影劑到達(dá)特定組織時，利用高機(jī)械指數(shù)的超聲輻照破壞微泡，使微泡攜帶的藥物或治療基因在特定組織釋放，從而達(dá)到對病變部位的靶向治療。UTMD可增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性，增加細(xì)胞對DNA或其他大分子物質(zhì)的攝取，為實(shí)現(xiàn)靶向基因傳輸提供了可能。通過UTMD可極大降低當(dāng)前臨床系統(tǒng)給藥的危險，在增加基因傳輸?shù)耐瑫r把影響局限在特定部位和治療時間。更重要的是與病毒載體相比，此方法并發(fā)癥少，具有高效性、低細(xì)胞毒性和靶向性的特點(diǎn)，是一種有效的非病毒、適合體內(nèi)基因傳輸?shù)霓D(zhuǎn)染技術(shù)[13-14]。

研究表明，UTMD介導(dǎo)基因傳輸主要與超聲空化效應(yīng)有關(guān)[15-16]。這種空化效應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞膜損傷，在細(xì)胞膜表面形成許多大小不等、數(shù)量不一的小孔(聲孔效應(yīng))，并可使周圍靶細(xì)胞間隙增寬。同時，微泡破裂產(chǎn)生的沖擊波可促使從微泡上釋放出來的藥物或基因進(jìn)入靶細(xì)胞。在特定空間和特定時間發(fā)射超聲擊破超聲微泡造影劑，通過產(chǎn)生的空化效應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)，使外源大分子有機(jī)會通過這些小孔、間隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為DNA轉(zhuǎn)染和表達(dá)外源基因產(chǎn)物提供了基礎(chǔ)，有望實(shí)現(xiàn)并增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染及表達(dá)。研究證實(shí)，UTMD已成功應(yīng)用于體外[17-18]和體內(nèi)研究[19-20]，是一種安全、有效的非病毒基因傳輸技術(shù)。

3　UTMD介導(dǎo)基因傳輸治療心血管疾病的體外應(yīng)用

UTMD介導(dǎo)基因傳輸治療心血管疾病的主要靶組織是心肌和血管。Lawrie等[17]研究發(fā)現(xiàn)，超聲輻照可使裸DNA在血管內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率能提高10倍，在聯(lián)合應(yīng)用超聲微泡后，基因轉(zhuǎn)染率能提高3 000倍。Miura等[18]以冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，利用超聲輻照攜帶有反義寡核苷酸(AS-ODNs)的超聲微泡，結(jié)果證實(shí)，UTMD能明顯增強(qiáng)AS-ODNs在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)。汪國忠等[21]通過超聲破壞載基因微泡介導(dǎo)報告基因(β-galactosidase質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，結(jié)果表明UTMD能明顯增強(qiáng)報告基因在心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平，在優(yōu)化輻照參數(shù)后對細(xì)胞活性并無明顯影響，再次證實(shí)UTMD是一種高效的非病毒基因轉(zhuǎn)染方法。

4　UTMD介導(dǎo)基因傳輸治療心血管疾病的體內(nèi)應(yīng)用

4.1UTMD與缺血性心臟病基因治療缺血性心臟病的主要機(jī)制為促進(jìn)心肌缺血區(qū)域的血管新生，改善心肌血流灌注。有研究發(fā)現(xiàn)，一些多肽類生長因子具有促進(jìn)血管生成的作用，給予外源性生長因子可有效促進(jìn)新生血管形成及缺血組織的側(cè)支循環(huán)建立，改善組織缺血，稱之為“治療性血管生成”[22]。在治療缺血性心臟病的基因選擇方面，目前多采用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、血管緊張素1(Ang-1)等[23-24]。

HGF不僅是強(qiáng)有力的肝細(xì)胞分裂因子，亦是一種血管生成因子，通過與血管上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞上相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)缺血組織血管再生[25]。2004年Kondo等[26]首先報道利用攜帶基因的超聲微泡造影劑治療缺血性心臟病，利用超聲破壞攜帶HGF的超聲微泡可實(shí)現(xiàn)HGF在急性心肌梗死大鼠心腔內(nèi)靶向釋放，結(jié)果顯示UTMD介導(dǎo)HGF靶向傳輸可明顯增加HGF在心肌組織中的轉(zhuǎn)染率及表達(dá)水平，促進(jìn)心肌組織中新生血管的形成，減小心肌梗死面積并抑制心肌梗死后左室重構(gòu)。Cong 等[20]以心肌梗死大鼠為模型，取得了類似的效果。研究證實(shí)UTMD可介導(dǎo)干細(xì)胞因子(SCF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(SDF-1α)靶向傳輸，增加SCF和SDF-1α在心肌梗死區(qū)的表達(dá)，提高祖細(xì)胞及新生血管生成，改善心肌組織重構(gòu)、再灌注及心功能[27]。Zhigang等[28]用UTMD介導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)染大鼠缺血心肌，結(jié)果顯示VEGF在大鼠心肌組織的表達(dá)水平明顯升高，缺血心肌組織新生血管增多，證實(shí)UTMD介導(dǎo)基因靶向傳輸在治療缺血性心臟病中具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.2UTMD與冠狀動脈介入治療經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)是目前治療急性冠脈綜合征(ACS)的有效方法，PCI術(shù)后支架內(nèi)再狹窄是影響患者遠(yuǎn)期療效的主要問題。PCI易導(dǎo)致內(nèi)皮及內(nèi)皮下組織損傷，引起血小板激活和炎性遞質(zhì)釋放進(jìn)而加劇血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖并最終引起支架內(nèi)再狹窄。因此，將特定基因?qū)霌p傷血管內(nèi)，通過抑制炎癥反應(yīng)加速內(nèi)皮修復(fù)，有望防治PCI術(shù)后再狹窄。研究證實(shí)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)可促進(jìn)核因子κB(NF-κB)抑制蛋白(IκB-α)降解，進(jìn)而激活NF-κB，后者可通過調(diào)控炎性因子(如單核細(xì)胞趨化蛋白3，MCP-3)的表達(dá)，在防治血管再狹窄中起重要促進(jìn)作用[29]。組織因子途徑抑制劑(TFPI)可抑制TNF-α誘發(fā)的NF-κB活化，在防治血管再狹窄中具有可觀前景[29]。Wang等[19]用球囊損傷兔的頸動脈，將帶有TFPI-2的超聲微泡注入體內(nèi)后用超聲進(jìn)行輻照，結(jié)果顯示超聲輻照組可明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-2表達(dá)，進(jìn)而抑制血管內(nèi)血栓形成并起到抗血管再狹窄作用。引誘劑(decoy)轉(zhuǎn)染是抑制基因活化的重要技術(shù)。將 decoy導(dǎo)入靶細(xì)胞后，decoy可與胞漿內(nèi)特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，抑制特定基因激活[30]。NF-κB decoy可阻止NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制多種炎性遞質(zhì)表達(dá)并最終起到抗炎作用。Inagaki等[31]通過建立大鼠股動脈損傷模型，將攜帶有NF-κB decoy的超聲微泡注入小鼠體內(nèi)，通過超聲輻照實(shí)現(xiàn)基因在損傷血管靶向傳輸，與對照組相比，超聲輻照組的內(nèi)膜/中層面積比明顯減小，損傷動脈中的炎性因子水平亦有所下降，證實(shí)UTMD可介導(dǎo)NF-κB引誘劑在損傷血管靶向傳輸，進(jìn)而抑制新生內(nèi)膜的形成，防治PCI術(shù)后再狹窄。RNA干擾(RNAi)是指利用雙鏈RNA(dsDNA)誘導(dǎo)同源靶基因的mRNA特異性降解，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象，在心血管疾病的治療中具有重要作用[32]。內(nèi)源性或外源性dsDNA被Dicer酶切割成21～23 nt的小分子干擾RNA(siRNA)，后者與蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)。此后，RISC介導(dǎo)siRNA解旋，并使反義鏈與其互補(bǔ)同源靶mRNA結(jié)合并將其切斷，引發(fā)靶mRNA降解，起到轉(zhuǎn)錄后基因沉默作用[33]。Suzuki等[34]通過建立小鼠股動脈損傷模型，將攜帶siRNA的超聲微泡注入體內(nèi)并進(jìn)行超聲輻照，結(jié)果顯示UTMD可明顯增加損傷動脈內(nèi)siRNA轉(zhuǎn)染率，進(jìn)而抑制血管內(nèi)膜增生，并且這種方法并沒有造成組織損傷或機(jī)體不良反應(yīng)，證實(shí)UTMD是一種安全有效的基因傳輸技術(shù)，在基因治療心血管疾病或炎癥性疾病中具有重要作用。

5　存在的問題和展望

UTMD介導(dǎo)基因傳輸在心血管疾病中的研究雖取得了較多成果，但仍存在如下問題：(1)超聲參數(shù)和微泡數(shù)量的應(yīng)用：UTMD介導(dǎo)基因傳輸可明顯增加治療基因在靶組織的轉(zhuǎn)染水平，但最佳超聲參數(shù)目前還沒有統(tǒng)一結(jié)論。研究表明，使用過高的超聲參數(shù)雖可介導(dǎo)基因的高效轉(zhuǎn)染，亦可產(chǎn)生不利的生物學(xué)效應(yīng)，如毛細(xì)血管破裂、出血等，因此如何利用最佳的微泡參數(shù)達(dá)到最好的轉(zhuǎn)染效果是目前需要解決的問題[35-36]；(2)對于不同基因不同模型下的最佳轉(zhuǎn)染條件，目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；(3)UTMD聯(lián)合攜基因超聲微泡在動物實(shí)驗(yàn)研究中取得了令人鼓舞的成績，但應(yīng)用于臨床的安全性和有效性尚需進(jìn)一步研究和論證。近年來，超聲微泡造影劑的研制亦取得了較大進(jìn)展，主要表現(xiàn)在超聲微泡造影劑的直徑減小(<8 μm)，使其能經(jīng)外周靜脈注射后通過肺循環(huán)最終到達(dá)靶器官或靶組織，而由微泡引起的其他臟器并發(fā)癥亦未見報道，但為減少微泡用量和避免基因浪費(fèi)，結(jié)合特異性配體的靶向超聲造影劑有待進(jìn)一步研究。

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