周美云，李毅群，陳填烽，鄭文杰*

(暨南大學(xué)化學(xué)系，廣東 廣州 510632)

大蒜是人體循環(huán)及神經(jīng)系統(tǒng)的天然強(qiáng)健劑[1-5]。數(shù)千年來(lái)在中國(guó)、埃及、印度等國(guó)，大蒜既作為食物又作為傳統(tǒng)藥物而廣泛應(yīng)用。在美國(guó)，大蒜新素制劑已排在人參、銀杏等保健藥物中的首位，它的保健功能可謂婦孺皆知。一般認(rèn)為，大蒜的營(yíng)養(yǎng)保健作用與所含硫化合物的抗氧化作用密切相關(guān)[6-9]。

富硒大蒜是指含硒量較高的大蒜[10-12]，其具有比普通大蒜更強(qiáng)的生物活性，可強(qiáng)化大蒜抑制人體白血病、胃癌、肝癌、卵巢癌、口腔癌的作用[13-15]。其原因自然與硒元素有關(guān)。硒與硫同屬一主族，其能夠取代硫直接插入蒜氨酸的代謝途徑，生成硒代蒜氨酸，進(jìn)一步產(chǎn)生各類含硒化合物[11]，硒代大蒜新素是富硒大蒜中含量最高的含硒化合物，與大蒜新素互為同系物(用硒取代了大蒜新素中的硫元素)，結(jié)構(gòu)相似。硒代大蒜新素在大蒜中的含量，是區(qū)別普通大蒜與富硒大蒜的主要指標(biāo)，通過(guò)對(duì)硒代大蒜新素與大蒜新素的生物活性比較，可以為普通大蒜與富硒大蒜在生物活性上的差異提供有力的解釋。遺憾的是，即使是富硒大蒜中含量最大的含硒化合物——硒代大蒜新素[16-18]，其含量依然很低，無(wú)法純化得到單體化合物，所以人們尚未準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)到該類化合物在生物活性中所扮演的關(guān)鍵角色。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成法，合成了大蒜新素與硒代大蒜新素，用比色法測(cè)定其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力、動(dòng)力學(xué)特性以及IC50，并比較兩者在抗氧化活性方面的差異，初步揭示富硒大蒜中硒代大蒜新素的抗氧化功能，為富硒大蒜具有比普通大蒜更好的抗氧化活性提供了新的解釋，亦為富硒大蒜的推廣提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

硒粉、硼氫化鈉、溴丙烯、高純硫、硫化鈉 阿拉丁試劑(上海)有限公司。

UV3600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；電子天平Acculab ALC210 德國(guó)Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 大蒜新素與硒代大蒜新素的合成

1.2.1.1 合成大蒜新素

首先按文獻(xiàn)[19]方法合成二硫化鈉，然后在攪拌條件下小心緩慢滴入化學(xué)計(jì)量的溴丙烯，滴加完畢后加熱回流3h。而后用石油醚萃取，用硅膠柱純化得到大蒜新素樣品，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 大蒜新素(a)與硒代大蒜新素(b)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of allicin (a) and Se-allicin (b)

1.2.1.2 硒代大蒜新素的合成[20]

取4g(0.1mol)氫氧化鈉固體溶于50mL水中，然后加入7.9g(0.1mol)硒粉和0.001g四乙基溴化銨。另取0.5g(0.0132mol)硼氫化鈉固體和0.4g(0.01mol)氫氧化鈉固體，并于冰水浴中加入10mL水溶解，而后于氮?dú)獗Ｗo(hù)和強(qiáng)烈攪拌下將硼氫化鈉堿液滴入上述的硒溶液中，室溫條件下反應(yīng)1h后，升溫至90℃反應(yīng)30min，得到具有特征棕紅色0.05mol的堿性二硒化鈉水溶液。將制得的上述溶液與烯丙基溴攪拌3h，生成黃色溶液，過(guò)濾分離，即得硒代大蒜新素。

1.2.2 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

取無(wú)水乙醇配制成的5×10-5mol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基溶液2mL加入10mL比色管中，再加入一定量抗氧化劑溶液，無(wú)水乙醇補(bǔ)充體積至10mL刻度，充分混勻30min后在520nm左右波長(zhǎng)處檢測(cè)其吸光度，并按下式計(jì)算其清除率。

式中：A0為無(wú)抗氧化劑空白的吸光度；AS為加抗氧化劑時(shí)吸光度。

1.2.3 半數(shù)抑制率(IC50)的計(jì)算

以樣品的濃度對(duì)自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算IC50值，其中IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需抗氧化劑的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH反應(yīng)體系的吸收光譜及測(cè)定波長(zhǎng)的確定

DPPH自由基其醇溶液呈紫色，當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。本研究對(duì)DPPH自由基、大蒜新素及硒代大蒜新素的乙醇溶液進(jìn)行UV-Vis光譜掃描，結(jié)果如圖2所示。DPPH溶液在517nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)特征吸收峰，而大蒜新素以及硒代大蒜新素在450nm波長(zhǎng)以上范圍沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明這兩種物質(zhì)本身不會(huì)對(duì)反應(yīng)測(cè)定造成干擾。

圖2 DPPH溶液、大蒜新素、硒代大蒜新素的UV-Vis光譜吸收曲線Fig.2 Absorption spectra of DPPH, Se-allicin and allicin

圖3 添加硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)后DPPH溶液UV-Vis光譜吸收曲線的變化Fig.3 Effect of the presence of Se-allicin (a) or allicin (b) on absorption spectrum of DPPH

由圖3可知，加入上述兩物質(zhì)后，DPPH溶液在517nm波長(zhǎng)處的吸收峰呈劑量效應(yīng)，具有較好的線性關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)選擇517nm波長(zhǎng)作為DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 DPPH體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，體系反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)間是關(guān)鍵影響因素。為了解所采用的DPPH體系的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性，研究DPPH溶液在加入大蒜新素和硒代大蒜新素后吸光度隨時(shí)間變化的規(guī)律，如圖4所示，在5×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中分別加入硒代大蒜新素(終濃度分別為4.6、12μmol/mL)和大蒜新素(終濃度為180、370μmol/mL)樣品后，體系的特征吸收峰A517nm在4min內(nèi)顯著下降，在4min后，體系基本趨于平衡，至30min時(shí)，A517nm達(dá)到完全穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明對(duì)于不同的抗氧化劑，30min是合適、穩(wěn)定的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，可進(jìn)一步用于劑量效應(yīng)研究。

圖4 添加硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)后DPPH溶液在517nm波長(zhǎng)處的吸光度隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig.4 Changes over time in absorbance at 517 nm of DPPH with added Se-allicin (a) or allicin (b)

2.3 抗氧化劑清除DPPH自由基的劑量效應(yīng)及其對(duì)比評(píng)價(jià)

圖5 硒代大蒜新素(a)與大蒜新素(b)對(duì)DPPH自由基抑制作用的劑量與線性關(guān)系Fig.5 Linear dose-dependent DPPH free radical scavenging activity of Se-allicin (a) and allicin (b)

根據(jù)以上選定的測(cè)定波長(zhǎng)和反應(yīng)時(shí)間，測(cè)定一系列濃度(倍比稀釋)的大蒜新素和硒代大蒜新素對(duì)DPPH自由基的清除率，計(jì)算相應(yīng)抗氧化劑的IC50值，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。由圖5可知，對(duì)于DPPH反應(yīng)體系，硒代大蒜新素和大蒜新素分別在2.5～30μmol/mL和180～500μmol/mL的濃度范圍內(nèi)對(duì)自由基清除率有良好的線性關(guān)系，據(jù)此可計(jì)算硒代大蒜新素、大蒜新素的IC50值分別為15.3、387μmol/mL。結(jié)果提示，富硒大蒜中硒元素插入蒜氨酸的代謝途徑后，產(chǎn)生的含硒化合物比對(duì)應(yīng)的含硫化合物的抗氧化活性大幅增加，這在一定程度上說(shuō)明了富硒大蒜具有更高生物活性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的原因，也預(yù)示著富硒大蒜具備良好的市場(chǎng)前景和開(kāi)發(fā)潛力。

3 結(jié) 論

通過(guò)化學(xué)合成手段，制備了大蒜中最具代表性的含硫化合物——大蒜新素，以及富硒大蒜中的特征化合物——硒代大蒜新素，研究并比較了兩者清除DPPH自由基的能力及其光譜學(xué)特征。結(jié)果表明：采用分光光度法測(cè)定兩者清除DPPH自由基能力，確定其測(cè)定波長(zhǎng)為517nm，穩(wěn)定時(shí)間為30min。在優(yōu)化的反應(yīng)體系中，硒代大蒜新素與大蒜新素對(duì)DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為15.3、385μmol/mL，硒代大蒜新素的抗氧化活性明顯強(qiáng)于大蒜新素，為富硒大蒜比普通大蒜具有更強(qiáng)的生物活性這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的解釋提供了一定的依據(jù)，預(yù)示著富硒大蒜具備良好的市場(chǎng)前景和開(kāi)發(fā)潛力。

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