楊 鋒，陳錦屏，林心怡

(1.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；2.廣西工學(xué)院生物與化學(xué)工程系，廣西 柳州 545006)

醋蛋是流傳于民間的一項(xiàng)驗(yàn)方，以米醋為基質(zhì)，加入雞蛋浸泡而成。醋使蛋清中的蛋白分子降解，釋放出具有活性的蛋白寡肽及氨基酸[1]。研究[2-4]表明醋蛋中的活性肽具有很強(qiáng)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制作用，具有降血壓功能。另外，陳黎斌等[5]用胃蛋白酶-胰酶復(fù)合酶體系水解醋蛋液，發(fā)現(xiàn)醋蛋水解液具有一定的抗氧化活性。

美拉德反應(yīng)是食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與羰基化合物(糖類)發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)，已有研究[6]表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的類黑精、還原酮以及一些含N、S的雜環(huán)化合物具有抗氧化活性。沈晗等[7]研究發(fā)現(xiàn)醬渣多肽的美拉德熱反應(yīng)產(chǎn)物具有較高的抗氧化活性和很好的應(yīng)用價(jià)值；孟艷麗等[8]采用鰱魚肽與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物表現(xiàn)出很好的抗氧化活性。Benjakul等[9]研究豬血蛋白和還原糖的美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也具有抗氧化活性，并且抗氧化活性與體系的褐變程度和中間產(chǎn)物的形成有關(guān)。Gu等[10]研究酪蛋白和葡萄糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性，結(jié)果表明不同分子質(zhì)量的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有不同的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)采用醋蛋多肽與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，研究美拉德反應(yīng)對(duì)醋蛋多肽抗氧化活性的影響，為進(jìn)一步提高醋蛋液的開發(fā)價(jià)值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋購(gòu)于廣西柳州潭中市場(chǎng)；9°米醋王 廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ UV-2000型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；TGL-16G離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-2冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-8電熱恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；PHS-3D精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 醋蛋多肽的制備

挑選大小均一的雞蛋，洗去表面污垢，用75%酒精擦拭雞蛋表面，晾干后稱質(zhì)量，以醋蛋比3∶1(V/m)加入米醋于20～25℃密封浸泡36h，挑破蛋膜，用紗布過(guò)濾，得醋蛋液。將醋蛋液煮沸后于5000r/min離心20min，取上清液減壓濃縮后凍干得醋蛋多肽，備用。

1.3.2 美拉德反應(yīng)

取0.2g醋蛋多肽粉末，溶于20mL蒸餾水，按不同醋蛋多肽、葡萄糖質(zhì)量比例加入葡萄糖，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至所需值，置于不同溫度條件下反應(yīng)至所需時(shí)間，得到反應(yīng)樣品液，備用。

1.3.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 Fe3+還原能力的測(cè)定

參照Oyaizu[11]的方法，略作修改。取1mL樣品液于具塞試管中，加入2.5mL 0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5mL 10g/100mL的K3Fe(CN)6溶液并混合均勻，于50℃保溫20min后快速冷卻，加入2.5mL 10g/100mL的三氯乙酸溶液，過(guò)濾。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和1mL 0.1g/100mL的FeCl3，混合均勻，靜置10min 后測(cè)定700nm波長(zhǎng)處的吸光度，吸光度越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照Tang Chuanhe等[12]的方法，略作修改。用無(wú)水乙醇配制0.1mmol/L DPPH溶液，避光保存。將2mL樣品液及2mL DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，室溫條件下靜置30min后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(At)，同時(shí)測(cè)定DPPH 溶液與2mL蒸餾水混合后的吸光度(Ac)，以及2mL樣品液與2mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度(Ab)。按照式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率，清除率越大則抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.4 美拉德反應(yīng)過(guò)程中指標(biāo)的測(cè)定

1.3.4.1 pH值

反應(yīng)后的樣品液直接用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.3.4.2 294、420nm波長(zhǎng)處的吸光度

將反應(yīng)后的樣品液用蒸餾水稀釋5倍后，用蒸餾水做空白對(duì)照，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定294、420nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4.3 接枝度

參照Lertittikul等[13]的方法，略作修改。取反應(yīng)后的樣品液0.4mL與 2mL pH8.2的磷酸鹽緩沖液混合，再加入1mL 0.01g/100mL TNBS試劑，振蕩混勻，在50℃水浴中避光反應(yīng)30min，然后再加入2mL 0.1mol/L Na2SO3溶液終止反應(yīng)，在室溫條件下放置30min后在420nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。空白對(duì)照是在相同操作條件下以蒸餾水代替0.01g/100mL TNBS試劑。按式(2)計(jì)算接枝度。

式中：A0表示未反應(yīng)時(shí)樣品吸光度；At表示反應(yīng)t時(shí)間后樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)條件對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

2.1.1 醋蛋多肽、葡萄糖質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖1 醋蛋多肽、葡萄糖質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.1 Effect of the ratio between peptide from vinegar-egg and glucose on antioxidant activity of Maillard reaction products

在反應(yīng)初始pH9、反應(yīng)溫度90℃、反應(yīng)時(shí)間90min的條件下，改變葡萄糖的添加量，考察醋蛋多肽、葡萄糖質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響。由圖1可知，不同醋蛋多肽與葡萄糖反應(yīng)質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性有一定程度的影響。隨著葡萄糖添加量的增大，反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原能力有所升高，當(dāng)醋蛋多肽與葡萄糖的質(zhì)量比達(dá)到1∶2時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng)，其中DPPH自由基清除率為58.1%、Fe3+還原能力(A700nm)為0.653，繼續(xù)增加葡萄糖的用量，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性反而有所下降，這與朱敏[14]的研究結(jié)果相似，即在研究精氨酸和木糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)精氨酸和木糖的物質(zhì)的量比為1∶1時(shí)，產(chǎn)物的抗氧化活性最好，比例過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響產(chǎn)物的抗氧化活性，其中的原因有待于進(jìn)一步研究。因此，在進(jìn)行美拉德反應(yīng)時(shí)，選擇醋蛋多肽、葡萄糖的質(zhì)量比為1∶2。

2.1.2 反應(yīng)初始pH值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與反應(yīng)初始pH值密切相關(guān)，因?yàn)閜H值影響著氨基酸的存在形式，進(jìn)而影響到美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。高pH值有利于美拉德反應(yīng)的起始縮合反應(yīng)的進(jìn)行，也有助于糠醛類產(chǎn)物經(jīng)Amadori重排成還原酮類產(chǎn)物，引起褐變，而褐變的程度與產(chǎn)物的抗氧化活性直接相關(guān)[13]。在醋蛋多肽、葡萄糖的質(zhì)量比為1∶2、反應(yīng)溫度90℃、反應(yīng)時(shí)間90min的條件下，改變反應(yīng)初始pH值，考察反應(yīng)初始pH值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響。由圖2可知，反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨著反應(yīng)初始pH值的增大而增加，在pH值為10時(shí)達(dá)到最大，之后又下降； Fe3+還原能力也隨著反應(yīng)初始pH值的增大而增加，在pH值為9時(shí)最大，之后有所降低，但是下降幅度不大。所以綜合來(lái)看，選擇反應(yīng)初始pH值為10。

圖2 反應(yīng)初始pH值對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of reaction initial pH on antioxidant activity of Maillard reaction products

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on antioxidant activity of Maillard reaction products

在醋蛋多肽、葡萄糖的質(zhì)量比為1∶2、反應(yīng)初始pH10、反應(yīng)時(shí)間90min的條件下，改變反應(yīng)溫度，考察反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響。由圖3可知，反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性影響很大，在低于100℃時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性隨著反應(yīng)溫度的增加而迅速增大，當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)100℃時(shí)，繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，反應(yīng)產(chǎn)物的活性增幅不大。因此選擇反應(yīng)溫度為100℃。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of reaction time on antioxidant activity of Maillard reaction products

在醋蛋多肽、葡萄糖的質(zhì)量比為1∶2、反應(yīng)初始pH10、反應(yīng)溫度100℃的條件下，改變反應(yīng)時(shí)間，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的影響。由圖4可知，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，在反應(yīng)進(jìn)行到120min時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性趨于穩(wěn)定，并且繼續(xù)反應(yīng)到180min時(shí)活性變化不大。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間120min。

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性與美拉德反應(yīng)進(jìn)程之間的關(guān)系

表1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與反應(yīng)進(jìn)程之間的關(guān)系Table 1 Correlation between antioxidant activity of Maillard reaction products and the process of Maillard reaction

為探討醋蛋多肽與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)后反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的變化與美拉德反應(yīng)進(jìn)程之間的關(guān)系，在上述優(yōu)化的美拉德反應(yīng)條件下，即醋蛋多肽、葡萄糖的質(zhì)量比為1∶2、反應(yīng)初始pH10、反應(yīng)溫度100℃，測(cè)定了美拉德反應(yīng)進(jìn)程中體系pH值的變化、中間產(chǎn)物(A294nm)的變化、褐變程度(A420nm)的變化、接枝度的變化以及抗氧化活性的變化。由表1可知，在醋蛋多肽與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)過(guò)程中，體系的pH值隨反應(yīng)的進(jìn)行不斷下降，且在120min內(nèi)下降幅度較大，之后趨于平穩(wěn)。這可能是因?yàn)槊览路磻?yīng)作用了一部分氨基，羰氨縮合反應(yīng)封閉了游離的氨基，致使反應(yīng)體系的pH值下降；另一方面由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)生一些有機(jī)酸，如乙酸和蟻酸，也使體系的pH值下降[15]。A294nm反映的是美拉德反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)色中間產(chǎn)物量的變化[16]，這些無(wú)色中間產(chǎn)物主要是由糖裂解產(chǎn)生的酮、醛類等小分子物質(zhì)[17]。在反應(yīng)120min內(nèi)，A294nm急劇增大，而后繼續(xù)反應(yīng)此吸光度變化不大。說(shuō)明這些無(wú)色中間產(chǎn)物主要在反應(yīng)的前120min內(nèi)生成并積累到一定濃度，繼續(xù)反應(yīng)，這些中間產(chǎn)物之間或與肽等發(fā)生聚合反應(yīng)，進(jìn)入美拉德反應(yīng)的終極階段，生成大分子的褐色物質(zhì)[17]。A420nm反映的是體系的褐變程度[18]。反應(yīng)時(shí)間短，體系的顏色較淺，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度增加，體系的顏色逐漸加深，表明形成了褐色的聚合體——類黑精。類黑精是一種以短肽和色素相結(jié)合的混合體，是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的主要抗氧化成分[19]。在反應(yīng)前120min內(nèi)，產(chǎn)物的褐變程度明顯，A420nm增幅較大，之后變化較小。綜合產(chǎn)物抗氧化活性隨反應(yīng)時(shí)間的變化結(jié)果來(lái)看，隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物的抗氧化能力也顯著增強(qiáng)，在120min后變化不大，這一變化趨勢(shì)與體系褐變程度的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與體系的褐變程度有關(guān)。接枝度是通過(guò)測(cè)定體系自由氨基的減少來(lái)計(jì)算的，反映的是美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度[20]。接枝度越小，表明美拉德反應(yīng)程度越低；接枝度越大，表明美拉德反應(yīng)程度越高。接枝度隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷上升，表明美拉德反應(yīng)一直進(jìn)行，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到120min后，接枝度的變化趨于平穩(wěn)，綜合產(chǎn)物抗氧化活性隨反應(yīng)時(shí)間的變化結(jié)果來(lái)看，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，反應(yīng)120min后，反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化活性的增加也趨于平穩(wěn)，這也進(jìn)一步說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度有關(guān)。

3 結(jié) 論

3.1 利用醋蛋多肽與葡萄糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)的優(yōu)化工藝條件為：醋蛋多肽、葡萄糖質(zhì)量比為1∶2、反應(yīng)初始pH10、反應(yīng)溫度100℃、反應(yīng)時(shí)間120min。在此條件下，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與醋蛋多肽相比，DPPH自由基清除率從12.7%增加到64.8%，F(xiàn)e3+還原能力(A700nm)從0.107增加到0.718。因此，美拉德反應(yīng)是提高醋蛋多肽抗氧化活性的有效方法。

3.2 反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性與美拉德反應(yīng)進(jìn)行的程度有關(guān)，反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性隨著體系pH值的降低、中間產(chǎn)物(A294nm)的增加、褐變程度(A420nm)的增加以及接枝度的增加而不斷增強(qiáng)。

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