王 菲，王常青*，樊 迎，于書佳，原 敏，連偉帥

(山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

黑豆為豆科植物大豆(Glycine max(L.) merr)的黑色種子[1]，黑豆主要分布在我國(guó)“三北”地區(qū)，約占全國(guó)大豆栽培面積的8%左右。黑豆按顆粒大小分為大粒種黑豆(大黑豆)和小粒種黑豆(小黑豆)。小黑豆俗稱馬料豆，蛋白質(zhì)含量比其他種類的大豆約高10%，達(dá)50%左右[2]，不但是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的高蛋白食材，而且從中醫(yī)角度來講有補(bǔ)腎強(qiáng)身、解毒益肝、壯筋骨、抗衰老之功效[3]。研究表明，在小黑豆蛋白中，乳清蛋白為8%～10%，其含量和分子質(zhì)量分布與其他大豆略有不同。小黑豆乳清蛋白中的主要成分是胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)，TI被普遍認(rèn)為是抗?fàn)I養(yǎng)因子，可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白質(zhì)的消化和吸收利用，同時(shí)TI還可作用于胰腺，造成胰腺肥大。有研究認(rèn)為，低濃度的TI可以降低癌癥發(fā)病率[1]，但本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，含TI 68%的乳清蛋白在低于1.5g/kg攝入劑量時(shí)，并不能體現(xiàn)顯著的抗腫瘤效果；而高于3g/kg劑量時(shí)抗腫瘤效果較好，但會(huì)造成動(dòng)物胰腺腫大。所以，本實(shí)驗(yàn)研究不同溫度熱處理小黑豆乳清蛋白，以求得在保持一定的抗癌活性的同時(shí)，降低其抗?fàn)I養(yǎng)性。實(shí)驗(yàn)還比較不同溫度處理的小黑豆乳清蛋白的抗腫瘤作用及其對(duì)免疫功能的影響，以研究和探討小黑豆乳清蛋白處理方法與抗腫瘤效果之間的關(guān)系，為小黑豆乳清蛋白功能食品的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用小黑豆由山西省靜樂縣農(nóng)業(yè)局提供；S180腹水瘤由山西省腫瘤醫(yī)院提供；綿羊紅細(xì)(SRBC)和豚鼠血清由山西醫(yī)科大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，4周齡，體質(zhì)量18～22g，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

2,4-二硝基氯苯(DNCB) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；注射用環(huán)磷酰胺 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽(BAPNA) 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sephadex凝膠色譜系統(tǒng)、UVD-680-3紫外檢測(cè)儀上海金達(dá)生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；低溫高速離心機(jī) 上海蘭亭設(shè)備有限公司；勻漿器 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司；光學(xué)顯微鏡 上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小黑豆乳清蛋白的制備與處理

將脫脂小黑豆粉與水按質(zhì)量比1:10混合，用NaOH調(diào)pH8.5，55℃提取1h，離心取上清；沉淀物以前述工藝提取2次，合并上清液，并調(diào)pH4.3沉淀去除球蛋白，得到小黑豆乳清蛋白濾液。該濾液經(jīng)高真空濃縮后，分為兩部分，并分別在65℃和75℃微波加熱10min，得到抗腫瘤實(shí)驗(yàn)所用的65℃處理蛋白和75℃處理蛋白。經(jīng)凝膠色譜分析乳清蛋白，得知其中胰蛋白酶抑制劑Kunitz和Bowman-Birk二者占乳清總蛋白的68%。

1.3.2 小黑豆中TI活性降低率的測(cè)定

采用改良的ISO 14902:2001《動(dòng)物飼料——大豆制品胰蛋白酶抑制劑活性的測(cè)定》標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)[4]。取10mL具塞玻璃離心管，按照以下方法加入溶液：1)標(biāo)準(zhǔn)空白：5mL BAPNA溶液，3mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；2)標(biāo)準(zhǔn)溶液：5mL BAPNA 溶液，3mL去離子水；3)樣品空白：5mL BAPNA 溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水，1mL 5.3mol/L醋酸；4)樣品溶液：5mL BAPNA溶液，1mL樣品稀釋液，2mL去離子水。充分混勻，于37℃水浴鍋中保溫10min。然后各管均加入1mL胰蛋白酶工作液，混勻，繼續(xù)保溫10min±5s，于2)管和4)管中分別加入1mL 5.3mol/L醋酸終止反應(yīng)。充分混合上述溶液，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)410nm處測(cè)定溶液吸光度(用標(biāo)準(zhǔn)空白調(diào)零)。該溶液能夠至少2h保持穩(wěn)定。

加熱處理后，乳清蛋白中TI活性降低率的計(jì)算方法[5]為：

式中：ΔA1是加熱處理后的乳清測(cè)得的吸光度與酶液的吸光度之差；ΔA2是原小黑豆乳清液測(cè)得的吸光度與酶液的吸光度之差。

1.3.3 S180腫瘤小鼠模型的建立

在無菌條件下抽取腹腔保種10d的小鼠S180細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3.0×107個(gè)/mL。除基礎(chǔ)組外，每只小鼠右腋皮下接種0.2mL腫瘤細(xì)胞懸液。

1.3.4 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)過程

動(dòng)物接種S180腫瘤后24h，隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、腫瘤模型組、環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組，65℃和75℃蛋白高、低劑量組共7組，每組10只小鼠。各高、低劑量蛋白組分別按10、3g/(kg·d)喂食(以乳清中的蛋白的質(zhì)量/體質(zhì)量計(jì))，陽性對(duì)照組腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/(kg·d)。實(shí)驗(yàn)期為14d。實(shí)驗(yàn)第9天，用DNCB致敏各組動(dòng)物(除基礎(chǔ)組)；第10天，對(duì)各組動(dòng)物進(jìn)行SRBC血清溶血素實(shí)驗(yàn)。14d實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定小鼠瘤徑、白細(xì)胞數(shù)量、免疫器官指數(shù)、耳腫脹度和血清半數(shù)溶血值等生化指標(biāo)。

1.3.5 免疫器官指數(shù)及白細(xì)胞數(shù)測(cè)定

各組動(dòng)物連續(xù)給藥14d后24h，稱體質(zhì)量并測(cè)量腫瘤直徑，眼眶取血計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)。之后處死動(dòng)物，剝離腫瘤、胸腺、脾臟等組織，用濾紙吸干后稱其質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率、瘤與體質(zhì)量比和各臟器指數(shù)[6]。

式中：d1、d2、d3為腫瘤3個(gè)互相垂直的直徑/mm。

1.3.6 細(xì)胞免疫-遲發(fā)型免疫變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)[7]

實(shí)驗(yàn)第9天，除基礎(chǔ)組外各組小鼠用脫毛劑脫毛腹部皮膚，面積約3cm×3cm，用1% DNCB溶液50μL均勻涂抹于脫毛處致敏。第14天用1% DNCB溶液10μL攻擊小鼠右耳?；A(chǔ)組同樣涂耳，攻擊24h后，頸椎脫臼處死，剪下左右耳殼，用R8mm打孔器取耳片稱質(zhì)量，以左右耳片質(zhì)量之差為腫脹度。

1.3.7 體液免疫-血清溶血素實(shí)驗(yàn)[8]

參照文獻(xiàn)[8]中方法制備綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和補(bǔ)體制備。實(shí)驗(yàn)第10天，用生理鹽水將壓積SRBC配成2%的細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2mL進(jìn)行免疫。

第14天實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24h，摘眼球取血，收集血清。每份血清用生理鹽水稀釋200倍，取稀釋血清1mL置試管內(nèi)，依次加入10% SRBC 0.5mL、10%補(bǔ)體1mL，另設(shè)不加血清的空白對(duì)照管(血清用生理鹽水代替)?；旌虾?7℃恒溫箱保溫30min，置冰浴中終止反應(yīng)。2000r/min離心取上清液1mL，加都氏試劑3mL；同時(shí)取10% SRBC 0.25mL，加都氏試劑至4mL與另一試管內(nèi)(該管測(cè)定的OD值即為SRBC半數(shù)溶血值)，充分混勻，放置10min后，于波長(zhǎng)540nm處以空白對(duì)照管調(diào)零，分別測(cè)定各管光密度值。按式(8)計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組半數(shù)溶血值HC50。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s表示，用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱對(duì)小黑豆乳清中TI活性的影響

小黑豆乳清蛋白經(jīng)65℃、10min微波處理后，TI活力降低率為30.2%；經(jīng)75℃、10min微波處理后，小黑豆TI活力降低率為55.0%。由此可見，小黑豆乳清蛋白經(jīng)65℃和75℃處理，TI均有所下降，且前者小于后者。

2.2 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用

表1 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

表1 小黑豆乳清蛋白對(duì)S180腫瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

注：a.與模型組相比，差異顯著(P＜0.05)；b.與模型組相比，差異極顯著(P＜0.01)； c.與65℃同劑量蛋白組相比差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別 平均瘤直徑/mm 瘤與體質(zhì)量的比/% 抑瘤率/%模型組 1.81±0.14 4.52±0.68陽性對(duì)照組 1.57±0.11b 2.13±0.91b 72.9 65℃蛋白高劑量組 1.56±0.04b 2.67±0.66b 35.8 65℃蛋白低劑量組 1.69±0.08a 3.82±1.02a 14.3 75℃蛋白高劑量組 1.46±0.03b 2.08±0.71bc 41.8 75℃蛋白低劑量組 1.53±0.06bc 2.93±0.88bc 20.5

由表1可見，與模型組相比，對(duì)于平均瘤徑和瘤與體質(zhì)量比兩項(xiàng)指標(biāo)來說，陽性對(duì)照組、75℃蛋白高、低劑量組和65℃蛋白高劑量組降低極顯著(P＜0.01)；65℃蛋白低劑量組降低顯著(P＜0.05)。各組抑瘤率順序?yàn)椋宏栃詫?duì)照組＞75℃蛋白高劑量＞65℃蛋白高劑量＞75℃蛋白低劑量＞65℃蛋白低劑量組。比較75℃和65℃同劑量蛋白組可見，在相同攝入劑量時(shí)，前者的瘤與體質(zhì)量比明顯低于后者(P＜0.05)。

2.3 小黑豆乳清蛋白對(duì)臟器指數(shù)的影響

由表2可見，各實(shí)驗(yàn)組胰臟指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，說明經(jīng)65℃和75℃處理的小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠胰腺無明顯影響，無致胰腺腫大作用?；A(chǔ)組的肝臟指數(shù)顯著低于模型組和各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，說明腫瘤移植會(huì)使小鼠的肝臟指數(shù)增加。胸腺和脾臟是機(jī)體的重要免疫器官，其結(jié)構(gòu)的正常與否直接影響機(jī)體的免疫功能。與模型組相比，陽性對(duì)照組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)降低極顯著(P＜0.01)，說明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠這兩個(gè)免疫器官有明顯的抑制作用。而75℃蛋白高、低劑量?jī)山M的胸腺指數(shù)與其他各組相比明顯提高(P＜0.05)，與基礎(chǔ)組處于同一水平。說明75℃處理組對(duì)荷瘤小鼠的免疫器官有明顯促進(jìn)作用，其效果好于65℃處理組。

表2 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

表2 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

肝臟指數(shù)/(mg/g)基礎(chǔ)組 7.42±1.79 0.98±0.32a 12.93±1.01 49.19±5.70a模型組 6.23±0.51 0.70±0.10 13.27±0.82 52.48±1.89陽性對(duì)照組 4.43±0.43b 0.45±0.03b 12.88±1.16 50.23±5.51 65℃蛋白高劑量組 6.97±1.43 0.82±0.16 12.90±0.61 53.68±0.40 65℃蛋白低劑量組 6.77±1.44 0.71±0.08 13.00±0.76 52.23±0.93 75℃蛋白高劑量組 7.96±1.84 1.08±0.04a 12.76±0.84 50.91±2.35 75℃蛋白低劑量組 6.82±0.59 0.93±0.20a 12.92±0.56 50.91±2.35組別 脾臟指數(shù)/(mg/g)胸腺指數(shù)/(mg/g)胰臟指數(shù)/(mg/g)

2.4 小黑豆乳清蛋白對(duì)免疫細(xì)胞及免疫功能的影響

表3 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫細(xì)胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

表3 小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫細(xì)胞及免疫功能的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

(106個(gè)/mL) 腫脹度/% 半數(shù)溶血值HC50基礎(chǔ)組 12.4±3.3b 19.5±2.67b 119.74±5.54b模型組 5.15±1.78 16.73±0.88 99.87±3.77陽性對(duì)照組 6.00±2.16 18.26±1.14b 119.20±2.95b 65℃蛋白高劑量組 9.67±0.58b 17.15±0.99a 113.04±5.59b 65℃蛋白低劑量組 7.12±1.32a 17.06±0.91a 109.27±2.76b 75℃蛋白高劑量組 13.50±1.11bc 19.43±0.49bc 121.18±5.43bc 75℃蛋白低劑量組 9.07±0.81bc 18.97±1.77bc 115.87±7.93bc組別 白細(xì)胞數(shù)/

由表3可見，各實(shí)驗(yàn)組血清溶血素值都比模型組極顯著提高(P＜0.01)；模型組的白細(xì)胞數(shù)、腫脹度和半數(shù)溶血值都顯著低于基礎(chǔ)組(P＜0.01)，免疫損傷最大。75℃蛋白高劑量組的白細(xì)胞數(shù)等3項(xiàng)免疫指標(biāo)與基礎(chǔ)組處于同一水平，免疫調(diào)節(jié)效果最好。與模型組比，陽性對(duì)照組小鼠的白細(xì)胞無顯著增加(P＞0.05)，65℃蛋白高、低劑量組顯著升高(P＜0.05)，75℃各實(shí)驗(yàn)組升高極顯著(P＜0.01)。陽性對(duì)照組和75℃蛋白高、低劑量組小鼠的耳殼腫脹度與模型組相比增加極顯著(P＜0.01)，65℃蛋白高、低劑量組的腫脹度增加顯著(P＜0.05)，說明各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞免疫功能下降有顯著抑制作用。75℃和65℃同劑量蛋白組對(duì)比，白細(xì)胞數(shù)、耳殼腫脹度和血清半數(shù)溶血值3個(gè)指標(biāo)均存在顯著差異(P＜0.05)，反映在小鼠的非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫方面，均為75℃處理組優(yōu)于65℃處理組。

3 討 論

有研究認(rèn)為，TI有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白質(zhì)消化吸收等抗?fàn)I養(yǎng)作用，并可致胰腺腫大或引發(fā)炎癥，但低濃度的TI具有降低癌癥發(fā)病率的作用[9-10]。一般認(rèn)為，當(dāng)一種受試物使腫瘤小鼠的抑瘤率達(dá)到30%以上時(shí)，表明該受試物可以有效抑制腫瘤生長(zhǎng)[11]。但是本實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)，含TI 68%的小黑豆乳清蛋白如果不經(jīng)熱處理，在低于1.5g/kg攝入劑量時(shí)的抗腫瘤效果不顯著；高于3g/kg劑量時(shí)抗腫瘤效果雖好，但會(huì)致動(dòng)物胰腺腫大。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)含TI 68%的小黑豆乳清蛋白75℃和65℃處理后，以3g/(kg·d)和10g/(kg·d)的劑量喂食小鼠，結(jié)果表明，小黑豆乳清蛋白在75℃和65℃處理后，TI活力分別降低了55.0%和30.2%，TI抗?fàn)I養(yǎng)性降低了，喂食小鼠后胰臟指數(shù)與基礎(chǔ)組相比無明顯差異；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，相同劑量條件下，所有75℃蛋白處理組的抑瘤率均優(yōu)于65℃蛋白組，75℃和65℃處理組的S180抑瘤率分別為41.8%、35.8%。因此，從降低抗?fàn)I養(yǎng)性和保持TI的較高抗腫瘤活性的角度看，用75℃處理乳清蛋白效果較好，而該溫度處理后抗腫瘤效果優(yōu)于65℃處理的原因可能是，75℃處理使乳清蛋白中TI的構(gòu)型改變適度，使具有增強(qiáng)免疫或抗腫瘤活性基團(tuán)的外展比65℃處理更充分[12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腫瘤移植會(huì)使小鼠的肝臟指數(shù)增加，可能是腫瘤細(xì)胞的繁殖對(duì)肝臟產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞代償性增生同時(shí)伴隨肥大[13]，從而使小鼠肝臟質(zhì)量增加。胸腺、脾臟是重要的免疫器官，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，75℃蛋白組的胸腺指數(shù)與65℃蛋白組及模型組相比明顯提高，這可能與小黑豆乳清蛋白在75℃處理后抗氧化能力提高及對(duì)機(jī)體的保護(hù)性提高有關(guān)。而各實(shí)驗(yàn)溫度和劑量的蛋白組動(dòng)物的脾臟指數(shù)與基礎(chǔ)組相比無顯著差異，說明小黑豆乳清蛋白對(duì)小鼠免疫器官無明顯抑制作用。而環(huán)磷酰胺陽性組小鼠的胸腺和脾臟器官都受到顯著的抑制。在相同劑量時(shí)，75℃處理組抑制荷瘤小鼠各項(xiàng)免疫功能下降的作用也明顯好于65℃處理，且呈一定的量效關(guān)系，與抑瘤率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，因此小黑豆乳清蛋白抗腫瘤作用可能是通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞、免疫分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力并防止腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，調(diào)動(dòng)和增強(qiáng)動(dòng)物抗腫瘤免疫活性；或者是通過增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫能力，起到間接抑制S180腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。至于熱處理溫度對(duì)乳清蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

[1]邵彪, 汪少蕓, 饒平凡.黑豆胰蛋白酶抑制劑的純化及性質(zhì)研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2010, 10(6): 47-53.

[2]王常青, 任海偉.小黑豆多肽加工工藝的研究[J].食品科學(xué), 2008,29(5): 231-233.

[3]陸恒.黑豆蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)勢(shì)及利用對(duì)策[J].中國(guó)商辦工業(yè),2003(2): 40-42

[4]史艷宇, 劉金華, 逄曉陽, 等.豆制食品中胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定方法的改進(jìn)[J].食品科學(xué), 2009, 30(12): 237-240.

[5]梁玉梅, 郭順堂.加熱處理對(duì)大豆乳清中胰蛋白酶抑制劑活性以及大豆乳清蛋白體外消化率的影響[J].食品工業(yè)科技, 2006, 27(11):79-81.

[6]李儀奎.中草藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社,1991: 512-517.

[7]BIN-HAFEEZ B, HAQUE R, PARVEZ S, et al.Immunomodulatory effects of fenugreek (Trigonella foenum graecumL.) extract in mice[J].International Immunopharmacology, 2003, 3(2): 257-265.

[8]毛跟年, 許牡丹.功能食品生理特性與檢測(cè)技術(shù)[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 395-396.

[9]WAN X S, WARE J H, ZHANG L, et a1.Treatment with soybean derived Bowman-Birk ihibitor increases serum prostate specific antigen concentration while supp ressing growth of human prostate cancer xenografts in nude mice[J].Nutr Cancer, 1999, 33(2): 174-177.

[10]STONE LAKE P S, JONES C E, NCOPTOLENOS J P, et a1．Proteinase inhibitors reduce basement membrane degradation by human breast cancer cell lines[J].Br J Cancer, 1997, 75(7): 951-959.

[11]宋擎, 柴秋彥, 張立偉.蘆筍總皂苷抗腫瘤作用研究[J].食品科學(xué),2010, 31(13): 273-275.

[12]黃惠華, 郭乾初, 梁漢華, 等.豆奶蛋白組分和胰蛋白酶抑制劑活性的熱變化[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2001, 23(2): 140-144 .

[13]莫開菊, 謝筆鈞, 龔晨睿.葛仙米多糖體內(nèi)抑瘤及對(duì)免疫的影響[J].食品科學(xué), 2008, 29(4): 392-396.