李鵬霄，茆廣華，趙 婷，鄒 燁，任月娜，白石琦，吳向陽，仰榴青,*

(1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

火棘(Pyracantha fortuneana)別名赤陽子、葉祥果、火把果、紅果、救軍糧等，是薔薇科火棘屬植物，在我國華東、華中及西南地區(qū)均有種植。火棘果中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的食用和藥用價(jià)值，是加工食品，提取天然色素、化妝品添加劑的重要野生資源；火棘果果皮中含有花色苷[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，花色苷具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝、調(diào)節(jié)心腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性，且具有較好的著色效果，在食品和化妝品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[4-8]?；鸺t色素是從火棘果中提取得到的一種水溶性色素，屬花色苷類，具有良好的熱穩(wěn)定性和耐光性，用途廣泛[9-10]。本實(shí)驗(yàn)從干燥火棘果中提取火棘果紅色素，采用C18Sep-Pak柱對(duì)提取物進(jìn)行初步純化，并研究純化產(chǎn)物的抗氧化活性，以期為火棘果紅色素的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然火棘果，江蘇大學(xué)校園內(nèi)采集，經(jīng)鑒定為薔薇科火棘屬植物火棘Pyracantha fortuneana的果實(shí)，于通風(fēng)處陰干后，用烘箱烘干，并保存于干燥器中備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、福林-酚試劑(FC)美國Sigma公司；雙氧水、水楊酸、氯化鉀、醋酸鈉、濃鹽酸、蒽酮、濃硫酸、硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C18Sep-Pak柱 美國Waters公司；BS 124S分析天平北京賽多利斯儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VIS-7220可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；TU-1800紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 火棘果紅色素的提取及純化

1.3.1.1 火棘果紅色素提取[11]

干燥火棘果用70%乙醇(pH3，HCl)于溫度40℃、物料比1:9(m/V)條件下，浸提3次，每次提取40min，過濾提取液，合并濾液，于50℃條件下減壓濃縮，得火棘果紅色素浸膏PFE(得率30.3%)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 C18Sep-Pak柱純化火棘果紅色素[12]

C18Sep-Pak柱用10mL甲醇活化后，用含0.01%鹽酸的水溶液平衡。取1.0g PFE用含0.01%鹽酸的水溶液溶解后，上樣，用約2000mL的0.01%的酸水洗脫，流出液棄去。用甲醇將富集在C18Sep-Pak柱上的色素洗脫至無色。收集的甲醇洗脫液，于30℃濃縮至干后，即得純化產(chǎn)物PPFE(得率0.55%)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 火棘果中活性成分的含量測(cè)定

分別稱取10g PFE及1g PPFE，用蒸餾水定容至100mL后用于花色苷、總酚及總糖含量的測(cè)定。

1.3.2.1 花色苷含量測(cè)定

采用pH示差法[13]測(cè)定提取物花色苷含量。準(zhǔn)確吸取PFE及PPFE水溶液各1mL，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液定容至10mL，并分別平衡50min和80min，以蒸餾水作空白，測(cè)定其在530nm和700nm波長處的吸光度，按式(1)計(jì)算花色苷含量。

式中：A=(A530nm－A700nm)pH1.0－(A530nm－A700nm)pH4.5；ε為為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)(26900L/(cm·mol))；DF為稀釋因子；Mw為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(449.4)；V為最終體積/mL；m為產(chǎn)品質(zhì)量/mg；L為光程(1cm)。

1.3.2.2 總酚含量測(cè)定

采用福林-肖卡爾法(FC法)[14]。精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的沒食子酸10mg，用蒸餾水溶解并定容到10mL。精密吸取沒食子酸溶液0.1、0.25、0.5、0.75、1mL于25mL容量瓶中，加蒸餾水定容，配成10、25、50、75、100 g/mL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取1mL不同質(zhì)量濃度的沒食子酸溶液，加入1.0mL 0.1mol/L FC試劑，充分混勻后，放置5min，再加入1.5mL 7.5g/100mL Na2CO3溶液，混勻后，顯色反應(yīng)2h，于765nm波長處測(cè)定吸光度，另以蒸餾水代替樣品液作為空白對(duì)照。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到?jīng)]食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= 0.0344x＋0.0968(R2=0.9986)。

準(zhǔn)確吸取PFE及PPFE溶液1.0mL，按照上述方法，于765nm波長處測(cè)定樣品液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每100g樣品中沒食子酸的毫克數(shù)計(jì)算總酚的含量。

1.3.2.3 總糖含量測(cè)定

總糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[15]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、60、80 g/mL的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取1.0mL試液放入具塞試管中，加入蒽酮試劑4.0mL，迅速浸于冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中10min，取出，冰浴中冷卻，在620nm波長處測(cè)定A，以不加樣品為空白，以標(biāo)準(zhǔn)糖含量(μg)為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0118x－0.007(R2=0.9998)。

樣品測(cè)定：配制質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的PFE及PPFE水溶解，按上述方法進(jìn)行操作，測(cè)定其在620nm波長處的A，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線以每100g樣品中葡萄糖的含量按式(2)計(jì)算計(jì)算總糖含量。

式中：C為含糖量/ g；m為樣品質(zhì)量/g；V總為樣品總體積/mL；V測(cè)為測(cè)定樣品體積/mL；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 PPFE體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.3.1 清除·OH的能力測(cè)定[16-17]

利用H2O2與Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成具有很高反應(yīng)活性的·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該物質(zhì)在510nm波長處有最大吸收。抗氧化劑加入后，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物生成量減少，減弱產(chǎn)物在波長510nm處的吸收峰。

依次將6mmol/L的FeSO4溶液、樣品溶液、H2O2溶液各2mL加入試管中，搖勻，靜置10min；加入6mmol/L水楊酸2mL，搖勻，靜置30min，于510nm波長處測(cè)定吸光度，以抗壞血酸(VC)作為陽性對(duì)照。樣品溶液為色素溶液時(shí)測(cè)得的吸光度為Ai，樣品溶液為蒸餾水時(shí)測(cè)得的吸光度為A0，用蒸餾水代替水楊酸測(cè)得的吸光度為Aj。按照式(3)計(jì)算清除率。

取0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.2)4.5mL，25℃水浴中預(yù)熱20min，依次加入樣品溶液和0.4mmol/L鄰苯三酚溶液各1mL，混勻，于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8mol/L的HCl溶液1mL，以Tris-HCl緩沖液作為參比，于325nm波長處測(cè)定其吸光度，以VC作為陽性對(duì)照。樣品溶液為色素溶液時(shí)測(cè)得的吸光度(Ai)，樣品溶液為蒸餾水時(shí)測(cè)得的吸光度(A0)，用蒸餾水代替鄰苯三酚溶液測(cè)得的吸光度為Aj。按照式(4)計(jì)算清除率。

1.3.3.3 清除DPPH自由基的能力測(cè)定[20-21]

取樣品溶液2mL于試管中，加入2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液2mL，混勻，暗處反應(yīng)30min后于517nm波長處測(cè)定其吸光度，以VC作為陽性對(duì)照。樣品溶液為色素溶液時(shí)測(cè)得的吸光度為Ai，樣品溶液為蒸餾水時(shí)測(cè)得的吸光度為A0，用乙醇代替DPPH乙醇溶液測(cè)得的吸光度為Aj。按照式(5)計(jì)算清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

平行實(shí)驗(yàn)為3次重復(fù)，數(shù)據(jù)處理采用軟件SPSS 16.0版(SPSS Inc., Chicago, USA)ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFE及PPFE中花色苷、總酚及總糖含量

圖1為pH3條件下火棘果紅色素提取液的吸收光譜，在400～800nm波長范圍內(nèi)火棘果紅色素提取液在530nm和656nm波長處有吸收峰，其中530nm波長處的吸收峰為火棘果紅色素的吸收峰。

PFE、PPFE中花色苷、總酚及總糖含量如表1所示。火棘果紅色素提取液通過C18Sep-Pak柱后，花色苷及總酚含量增高，總糖未檢出，表明C18Sep-Pak柱除糖效果好，且具有富集花色苷和總酚的作用。

圖1 火棘果紅色素提取液的吸收光譜圖(400～800nm)Fig.1 Absorption spectrum of pyracantha red pigment (400 to 800 nm)

表1 PFE、PPFE中花色苷、總酚及總糖含量Table 1 Contents of anthocyanins, total phenols and total sugar in the crude extract and the purified product

2.2 PPFE體外抗氧化活性

2.2.1 清除·OH能力

圖2 PPFE的·OH清除活性Fig.2 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on hydroxyl free radical

由圖2可知，隨著PPFE和VC質(zhì)量濃度的增大清除效果逐漸增強(qiáng)，在質(zhì)量濃度為2.0mg/mL時(shí)，PPFE和VC的清除率分別為61.04%、100%；在該體系中的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為1.43mg/mL和0.43mg/mL。

圖3 PPFE的 ·清除活性Fig.3 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on superoxide anion free radical

由圖3可知，清除率隨著PPFE和VC質(zhì)量濃度的增加而增大，但PPFE清除率變化幅度小于VC，PPFE和VC在該體系中的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為3.13mg/mL和0.22mg/mL。

2.2.3 清除DPPH自由基能力

圖4 PPFE的DPPH自由基清除活性Fig.4 Radical scavenging capacity of the purified red pigments on DPPH free radical

由圖4可知，清除率隨著PPFE和VC質(zhì)量濃度的增加而增大，在相同質(zhì)量濃度時(shí)，PPFE的清除率略低于VC。PPFE和VC在該體系中的半抑制質(zhì)量濃度IC50分別為3.43 g/mL和1.67 g/mL。

3 結(jié) 論

在本實(shí)驗(yàn)條件下，火棘果紅色素粗提物中花色苷含量為1.16mg/100g、總酚含量為2.18mg/100g、總糖含量為1095.34mg/100g；通過C18Sep-Pak柱純化后，花色苷含量增高至20.61mg/100g，總酚含量增高至48.62mg/100g，總糖未檢出，說明C18Sep-Pak柱除糖效果好，且具有富集花色苷和總酚的作用?？寡趸钚詼y(cè)定結(jié)果表明，火棘果紅色素純化物對(duì)DPPH自由基、·OH與·均有較強(qiáng)的清除作用，尤以對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)。

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