楊曉軍，高 芬

1延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院;2延安大學(xué)附屬醫(yī)院，延安 716000

刺孢吸水鏈霉菌是從陜西省定邊縣酸性土壤中分離得到的一株放線菌。針對放線菌細(xì)胞內(nèi)外次級代謝產(chǎn)物通常不同的特點(diǎn)［1］，本文在研究其菌絲體化學(xué)成分的基礎(chǔ)上［2］，又對其發(fā)酵液的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離得到5個化合物，利用IR、NMR和MS等方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，分別鑒定為芒柄花素 (1)，N-乙?；?2-(4-羥苯基)乙胺(2)，阿魏酸(3)，3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚(4)7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮(5);此外，還對分離得到的單體化合物1、2、4和5進(jìn)行了初步抗炎實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)報告如下:

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)菌株分離自中國陜西省定邊縣酸性土壤中，由延安大學(xué)生命科學(xué)院微生物研究所任桂梅教授利用16SrRNA基因序列分析法鑒定為刺孢吸水鏈霉菌Streptosporangium hygroscopicus n.sp.。

種子培養(yǎng)基:淀粉24 g，葡萄糖1 g，蛋白胨3 g，牛肉膏 3 g，酵母膏 5 g，CaCO34 g，水 1000 mL，pH 6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基:大豆粉20 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，淀粉 5 g，酵母膏 2 g，NaCl 4 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1000 mL，pH 6.5，28 ℃，培養(yǎng) 120 h。

1.1.2 儀器和其它材料

XRC-1型顯微熔點(diǎn)儀;IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司);AV-500型核磁共振儀 (瑞士Bruker公司);MAT-711型質(zhì)譜儀(美國Thermo公司);Vario EL有機(jī)元素分析儀(德國Elementar公司);1525型HPLC(Waters公司);Sephadex LH-20(Pharmacia產(chǎn)品);YLS-7A足趾容積測量儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站);柱層析硅膠100～200目(青島海洋化工廠產(chǎn)品)。CD大鼠，體重90～110 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號NO:0003240，許可證號:SCXK(陜)2007-001.;交叉菜膠(美國Sigma公司產(chǎn)品)。陽性對照組(復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠，批號:20100953)山東綠葉制藥有限公司.

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法

將生長良好的斜面接種于種子培養(yǎng)基，28℃、300 rpm搖床培養(yǎng)48 h，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1∶10，置于28℃、300 rpm搖床培養(yǎng)120 h。

1.2.2 提取與分離

將發(fā)酵120 h的發(fā)酵液以3 000 rpm離心，得上清液和菌絲體兩部分，上清液過裝有 Amberlite XAD-16型大孔吸附樹脂的固相萃取柱，然后依次用甲醇和丙酮洗脫吸附在大孔吸附樹脂上的次級代謝產(chǎn)物，將甲醇洗脫液減壓濃縮蒸干，獲得淺黃色粗浸膏，粗樣品用水溶解，溶解部分用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分經(jīng)過減壓濃縮后拌硅膠(200～300目)、晾干、上硅膠柱分離，以氯仿∶甲醇(V∶V)=20∶1→18∶1→16∶1→14∶1→12∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1梯度洗脫并分段收集得組分C、D和E。將組分C、D和E繼續(xù)上Sephadex LH-20凝膠柱，丙酮為洗脫劑進(jìn)行純化，各流分以HPLC(C-18色譜柱，4.6 mm ×150 mm，5 μm)檢測其純度。從組分C中分離得到化合物2和4;從組分D中分離得到化合物1和5;從組分E中分離得到化合物3。

1.2.3 化合物1、2、4和5對交叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響

將42只CD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(normal)、模型組、陽性對照組(復(fù)方七葉皂苷鈉凝膠)和化合物1、2、4和5組，共7組。每組6只，雌雄各半。正常組大鼠右后足趾皮下注入0.1 mL蒸餾水/只，其余6組均在大鼠右后足趾皮下注射1%交叉菜膠溶液(配置方法見文獻(xiàn)［3］)0.1 mL/只。致炎2 h后，陽性對照組和化合物1、2、4和5組每日定時腹腔注射給藥1次(劑量均為15 mg/kg)，連續(xù)給藥5 d。在致炎后第10 d，用排水法求出腫脹度，計算抑制率:抑制率(%)=(模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/模型組平均腫脹度×100%。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色固體，mp.254～255℃，與三氯化鐵反應(yīng)為陽性，提示含有酚羥基;ESI(+)-MS:(m/z)269［M+H］+，307［M+K］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為71.59%和4.51%;質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為C16H12O4;IR(KBr)νmaxcm-1:3 133(-OH)，3 031(Ar-H 伸縮振動)，1 641(共軛 C=O)，1 604，1 572，1 503(苯環(huán)骨架伸縮振動)，2 978，2 843，1 383(-CH3)。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:10.81(1H，brs，7-OH)為1個酚羥基質(zhì)子信號;8.33(1H，s，H-2)為異黃酮2位質(zhì)子的特征信號;7.93(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，6.95(1H，dd，J=8.7，2.4Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.47(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.98(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.76(3H，s，-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:153.7(C-2)，123.3(C-3)，174.9(C-4)，127.2(C-5)，115.4(C-6)，162.9(C-7)，101.9(C-8)，159.3(C-9)，116.7(C-10)，124.0(C-1')，130.2(C-2'，6')，113.8(C-3'，5')，157.6(C-4')，55.6(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道的芒柄花素數(shù)據(jù)一致，故化合物1為芒柄花素。

化合物2 白色固體，mp.134～136℃。三氯化鐵反應(yīng)陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)180 ［M+H］+，381［2M+Na］+;從元素分析得知碳、氫和氮的含量分別為67.01%、7.28%和7.79%;質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為 C10H13NO2;IR(KBr)νmaxcm-1:3341～3229(-NH，-OH)，3029(Ar-H 伸縮振動)，1639(C=O)，1608，1527，1508(苯環(huán)骨架伸縮振動)，847(1，4-二取代苯的結(jié)構(gòu))。1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:9.21(1H，brs，4'-OH)，7.86(1H，brs，-NH)，7.01(2H，d，J=8.2 Hz，H-2'，6')，6.69(2H，d，J=8.2 Hz，H-3'，5')，3.17(2H，m，H-1)，2.56(2H，m，H-2)，1.85(3H，s，CH3CO-);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:169.2(-C=O)，156.2(C-4')，130.1(C-1')，129.7(C-2'，6')，115.3(C-3'，5')，40.5(C-1)，34.0(C-2)，23.2(-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報道的N-乙?；?2-(4-羥苯基)乙胺數(shù)據(jù)一致，故化合物2為N-乙?；?2-(4-羥苯基)乙胺。

化合物3 白色針晶(甲醇)，mp.172～173℃，IR(KBr)cm-1:3 429(-OH)，1 690(羧 C=O)，1 627，1 516，1 498(苯環(huán)骨架伸縮振動)。ESI(+)-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z 195［M+H］;元素分析得碳、氫的百分含量分別為61.78、5.23;質(zhì)譜和元素分析推出該化合物的分子式C10H10O4，相對分子質(zhì)量為 194 。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:3.82(3H，s，-OCH3)，6.37(1H，d，J=15.4 Hz，H-8)，6.75(d，J=8.2 Hz，H-5)，7.09(dd，J=8.2，2.0 Hz，H-6)，7.26(d，J=2.0 Hz，H-2)，7.51(d，J=15.4 Hz，H-7);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:55.3(-OCH3)，112.2(C-2)，115.3(C-5)，115.9(C-6)，122.5(C-8)，125.6(C-1)，144.5(C-7)，147.6(C-4)，150.2(C-3)，167.8(C-9)。其理化數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照基本一致［6］，故鑒定為阿魏酸。

化合物4 白色針晶(甲醇)，mp.113～115℃，三氯化鐵反應(yīng)陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)153［M+H］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為70.98%和7.77%;質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為C9H12O2;IR(KBr)νmaxcm-1:3 275(-OH)，3 039(Ar-H 伸縮振動)，1 601，1 522(苯環(huán)骨架伸縮振動)，1 309，1 046，865(1，2，3，4，5-五取代苯的結(jié)構(gòu));1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:8.83(1H，brs，1-OH)，7.94(1H，brs，2-OH)，6.29(1H，s，H-6)，2.03(3H，s，3-CH3)，2.08(3H，s，4-CH3)，2.14(3H，s，5-CH3);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:154.3(C-1)，153.7(C-2)，135.6(C-3)，115.6(C-4)，110.2(C-5)，109.5(C-6)，9.7(3-CH3)，11.3(4-CH3)，19.8(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道的 5，7，4'-三羥基異黃酮數(shù)據(jù)一致，故化合物 4 為 3，4，5-三甲基-1，2-苯二酚。

化合物5 淺黃色針晶，m.p.250～252℃。三氯化鐵反應(yīng)陽性，示有酚羥基存在。ESI(+)-MS:(m/z)285［M+H］+，307［M+Na］+;從元素分析得知碳、氫的含量分別為67.32%和3.98%;質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為C16H12O5;IR(KBr)νmaxcm-1:3 221 ～3 396(-OH)，3 027(Ar-H 伸縮振動)，1 607，1 588，1 473(苯環(huán)骨架伸縮振動);1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:10.82(1H，brs，7-OH)，9.43(1H，brs，3'-OH)為 2 個酚羥基質(zhì)子信號;6.67(1H，s，H-3)為黃酮3位質(zhì)子的特征信號;7.86(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.90(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6)，6.95(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.03(1H，d，J=8.5 Hz，H-5')，7.55(1H，dd，J=8.5，2.0Hz，H-6')，3.85(3H，s，-OCH3).13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:162.4(C-2)，105.6(C-3)，176.4(C-4)，126.5(C-5)，115.2(C-6)，157.9(C-7)，102.3(C-8)，162.7(C-9)，116.0(C-10)，123.4(C-1')，113.1(C-2')，146.4(C-3')，159.7(C-4')，112.3(C-5')，117.8(C-6')，56.2(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8-9］報道的7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮數(shù)據(jù)一致，故化合物5為7，3'-二羥基-4'-甲氧基黃酮。

2.2 化合物1、2、4和5對交叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在給藥劑量相同的條件下，陽性對照組和化合物1、2、4和5對交叉菜膠所致大鼠足趾腫脹的抑制率分別為:48.8%，47.3%，16.8%，13.6%和50.4%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從一株耐酸鏈霉菌的發(fā)酵液中分離得到5個單體化合物，其中化合物1、4和5首次從放線菌中分離得到。抗炎實(shí)驗(yàn)研究表明，化合物1和5具有較強(qiáng)的抗炎作用;化合物3雖未進(jìn)行抗炎實(shí)驗(yàn)研究，但是有文獻(xiàn)報道它具有較強(qiáng)抗炎作用［10］，因此本實(shí)驗(yàn)初步研究結(jié)果為從本菌中尋找抗炎活性化合物打下了一定的基礎(chǔ)。

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