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      蟲類中藥蠐螬中含氮化合物研究

      2013-02-14 04:20:13晏永明李小年鐘惠民程永現(xiàn)
      關(guān)鍵詞:蠐螬丙氨酸柱層析

      李 林,晏永明,李小年,鐘惠民,程永現(xiàn)*

      1中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明650204;2青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院,青島266042

      昆蟲是自然界種類最為豐富的物種,藥用昆蟲更以其獨(dú)特的療效而被廣泛地應(yīng)用于臨床。蠐螬為節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱鞘翅目金龜子科昆蟲朝鮮黑金龜子Holotrichia diomphalia等同屬近緣昆蟲的干燥幼體,具有破血逐淤,明目退翳的功效,內(nèi)服可用于婦女經(jīng)閉、癥瘕等頑癥痼疾,外用可治丹毒、癰疽、痔漏、跌打損傷等[1]。現(xiàn)代臨床上有人將蠐螬制成滴眼液,用于治療白內(nèi)障、眼角膜翳的治療,效果顯著[2]?,F(xiàn)代藥理研究證明蠐螬具有抗腫瘤、保肝、抗菌等作用,如蠐螬石油醚提取物可誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡,蠐螬具有保肝作用等。相對(duì)于蠐螬突出的臨床療效,蠐螬的化學(xué)成分研究卻極為薄弱,雖然有報(bào)道稱蠐螬含有脂肪酸類、氨基酸、多肽或蛋白質(zhì)、糖類、生物堿、有機(jī)酸鹽、甾體化合物等,也有學(xué)者通過GC-MS分析表明蠐螬石油醚提取物含有反油酸、十六酸,硬脂酸等[3],但由于這些成分一般是動(dòng)物類中藥均含有的共性成分,因此至今人們對(duì)蠐螬的化學(xué)成分,尤其是小分子物質(zhì)認(rèn)識(shí)仍然嚴(yán)重不足。我們?yōu)榱私沂鞠擉┧幱玫幕瘜W(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),對(duì)該中藥進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究,從其乙醇提取物中分離得到13個(gè)含氮化合物,經(jīng)譜學(xué)方法鑒定其結(jié)構(gòu)為 N-[2-(4-羥苯基)-乙基]乙酰胺、環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)、吡啶-3-甲酰胺、胸苷、戊內(nèi)酰胺、5-(羥甲基)-1H-吡咯-2-醛、環(huán)(脯氨酸-纈氨酸)、環(huán)(脯氨酸-丙氨酸)、羥吲哚、1,2,3,4-四氫-1,3,4-三氧-(-咔啉、吲哚-3-醛、黃苷和苯基丙氨酸,以上化合物均為首次從該種動(dòng)物藥中分離得到。

      1 儀器與材料

      核磁共振波譜用 Bruker AM-400和Bruker Avance-600核磁共振儀測(cè)定,TMS作為內(nèi)標(biāo);ESIMS用Bruker HCT Esquire 3000離子阱質(zhì)譜儀;高效液相色譜儀型號(hào)為 Agilent 1200;薄層層析硅膠GF254和柱層析硅膠(200~300目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品;大孔吸附樹脂為天津海光化工有限公司D101樹脂;Sephadex LH-20為Pharmacia公司產(chǎn)品;反相硅膠RP-18和MCI gel CHP 20P分別為Daiso公司和三菱公司產(chǎn)品。

      2 提取與分離

      蠐螬(18 kg)購自安徽省亳州藥材交易中心,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室周小江副教授鑒定為朝鮮黑金龜子(Holotrichia diomphaliaBates)的干燥幼蟲,將藥材粉碎后用95%乙醇冷浸提取三次,每次3 d,減壓回收溶劑得浸膏2 kg,加水混懸,依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物55 g經(jīng)過反復(fù)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、MCI膠柱層析和反相柱層析,從中分得化合物1(130 mg)和2(4 mg)。正丁醇萃取物76 g經(jīng)過反復(fù)D101大孔吸附樹脂柱層析、硅膠柱層析、反相柱層析、MCIgel CHP 20P柱層析和Sephadex LH-20柱層析,從中分得化合物3(8 mg)和4(6 mg)。濃縮水相部分得浸膏740 g,取其一半370 g進(jìn)行分離,經(jīng)硅膠柱層析(氯仿∶甲醇15∶0~4∶1梯度洗脫),分為三部分EQ-1-EQ-3,經(jīng)過反復(fù)MCI gel CHP 20P柱層析、Sephadex LH-20柱層析、反相柱層析、硅膠柱層析及HPLC純化,從EQ-1部分得到化合物1(30 mg)、2(6 mg)、5(6 mg)、6(1 mg)、7(4 mg)、8(11 mg)、9(2 mg)、10(2 mg)和11(10 mg);從 EQ-2部分得到化合物4(11 mg);從EQ-3部分得到化合物12(3 mg)和13(9 mg)。

      3 結(jié)構(gòu)鑒定

      N-[2-(4-羥苯基)-乙基]乙酰胺 1 無色晶體;1H NMR(400 MHz,C5D5N):δH7.23(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),7.15(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),3.69(2H,m,H-7),2.92(2H,m,H-8),2.09(3H,s,H-10);13C NMR(100 MHz,C5D5N):δC170.6(s,C-9),157.5(s,C-4),130.6(s,C-1),130.5(d,C-2,6),116.4(d,C-3,5),42.0(t,C-8),35.6(t,C-7),23.2(q,C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值相符[4]。

      環(huán)(酪氨酸-脯氨酸)2 無色晶體;1H NMR(400 MHz,Acetone-d6):δH8.33(1H,br s,HN),7.15(2H,d,J=8.4 Hz,H-12,16),6.75(2H,d,J=8.4 Hz,H-13,15),6.59(1H,br s,OH),4.30(1H,dd,J=11.2,5.6 Hz,H-3),4.09(1H,t,J=7.6 Hz,H-6),3.50(1H,m,H-9),3.36(1H,m,H-9'),3.21(1H,dd,J=14.4,4.5 Hz,H-10),2.90(1H,dd,J=14.4,7.1 Hz,H-10'),2.04(1H,m,H-7),1.84(2H,m,H-7',8),1.66(1H,m,H-8');13C NMR(100 MHz,Acetone-d6):δC169.8(s,C-2),165.9(s,C-5),157.2(s,C-14),131.6(d,C-12,16),128.4(s,C-11),116.0(d,C-13,15),59.5(d,C-6),57.2(d,C-3),45.5(t,C-9),36.2(t,C-10),28.9(t,C-7),22.9(t,C-8)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[5]。

      吡啶-3-甲酰胺 3 白色粉末;1H NMR(400 MHz,CD3OD):δH9.01(1H,m,H-6),8.68(1H,m,H-3),8.28(1H,m,H-4),7.54(1H,m,H-5);13C NMR(100 MHz,CD3OD):δC169.8(s,C-7),152.8(d,C-2),149.4(d,C-6),137.3(d,C-4),131.4(s,C-3),125.1(d,C-5)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[6]。

      胸苷 4 白色粉末;ESI-MSm/z:307[M+Na]+.1H NMR(400 MHz,CD3OD):δH7.82(1H,d,J=1.0 Hz,H-6),6.28(1H,t,J=6.9 Hz,H-1'),4.40(1H,dd,J=5.9,3.4 Hz,H-3'),3.90(1H,dd,J=6.7,3.3 Hz,H-4'),3.76(2H,m,H-5'),2.22(2H,m,H-2'),1.88(3H,d,J=1.0 Hz,H-7);13C NMR(100 MHz,CD3OD):δC166.4(s,C-4),152.4(s,C-2),138.2(d,C-6),111.5(s,C-5),88.8(d,C-1'),86.2(d,C-3'),72.2(d,C-4'),62.8(t,C-5'),41.2(t,C-2'),12.4(q,C-7)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[7]。

      戊內(nèi)酰胺 5 白色粉末;1H NMR(600 MHz,CD3OD):δH4.71(1H,s,NH),3.30(2H,m,H-6),2.33(2H,m,H-3),1.82(2H,m,H-4),1.79(2H,m,H-5);13CNMR(150 MHz,CD3OD):δC175.0(s,C-2),43.0(t,C-6),32.0(t,C-3),23.0(t,C-5),21.7(t,C-4)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[8,9]。

      5-(羥甲基)-1H-吡咯-2-醛 6 無色膠狀物;1H NMR(600 MHz,CD3OD):δH9.26(1H,s,CHO),6.87(1H,d,J=3.7 Hz,H-3),6.16(1H,d,J=3.7 Hz,H-4),4.50(2H,s,CH2OH);13C NMR(150 MHz,CD3OD):δC180.6(s,CHO),143.4(s,C-5),134.0(s,C-2),124.8(s,C-3),110.4(d,C-4),57.8(t,CH2OH)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[10]。

      環(huán)(脯氨酸-纈氨酸)7 無色晶體;1H NMR(400 MHz,CDCl3):δH5.90(1H,br s,NH),4.08(1H,t,J=7.4 Hz,H-6),3.94(1H,s,H-3),3.62(1H,m,H-9),3.55(1H,m,H-9),2.63(1H,m,H-1'),2.37(1H,m,H-7),2.04(2H,m,H-7,8),1.91(1H,m,H-8),1.06(3H,d,H-2'),0.91(3H,d,H-3');13C NMR(100 MHz,CDCl3):δC170.0(s,C-5),164.7(s,C-2),60.3(d,C-6),58.8(d,C-3),45.1(t,C-9),28.5(t,C-7),28.3(d,C-1'),22.3(t,C-8),19.2(q,C-2'),16.0(q,C-3')。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[11]。

      環(huán)(脯氨酸-丙氨酸)8 無色晶體;1H NMR(400 MHz,CDCl3):δH6.62(1H,br s,NH),4.06(2H,m,H-3,6),3.62(1H,m,H-9),3.51(2H,m,H-9),2.28(1H,m,H-7),2.03(1H,m,H-7),1.96(1H,m,H-8),1.85(1H,m,H-8),1.41(3H,d,H-1');13C NMR(100 MHz,CDCl3):δC170.4(s,C-5),166.4(s,C-2),59.2(d,C-6),51.1(d,C-3),45.4(t,C-9),28.1(t,C-7),22.7(t,C-8),15.9(q,C-1')。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[12]。

      羥吲哚 9 白色粉末;1H NMR(600 MHz,CDCl3):δH7.59(1H,br s,NH),7.15(2H,m,H-6,7),6.96(1H,t,J=7.5 Hz,H-5),6.80(1H,d,J=7.5 Hz,H-4);13C NMR(150 MHz,CDCl3):δC176.9(s,C-2),142.1(s,C-7a),128.0(d,C-6),125.3(s,C-3a),124.9(d,C-4),122.4(d,C-5),109.5(d,C-7),36.1(t,C-3)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[13]。

      1,2,3,4-四氫-1,3,4-三氧-β-咔啉 10 黃棕色粉末;1H NMR(600 MHz,C5D5N):δH8.53(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.78(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.50(1H,t,J=8.0 Hz,H-7),7.45(1H,d,J=8.0 Hz,H-6);13C NMR(150 MHz,C5D5N):δC172.1(s,C-4),161.5(s,C-1),160.2(s,C-3),139.4(s,C-13),137.3(s,C-10),127.7(d,C-7),125.2(d,C-6),125.0(s,C-12),123.3(d,C-5),117.9(s,C-11),114.9(d,C-8)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[14]。

      吲哚-3-醛 11 白色粉末;1H NMR(400 MHz,CD3OD):δH9.88(1H,s,H-10),8.15(1H,d,J=7.3 Hz,H-5),8.10(1H,s,H-2),7.47(1H,d,J=8.0 Hz,H-8),7.26(2H,m,H-6,7);13C NMR(100 MHz,CD3OD):δC187.4(s,C-10),139.7(d,C-2),138.0(s,C-9),126.1(s,C-4),125.0(d,C-5),123.6(d,C-6),122.4(d,C-7),116.7(s,C-3),113.1(d,C-8)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[15,16]。

      黃苷12 白色粉末;ESI-MSm/z:166[M+H]+,188 [M+Na]+.1H NMR(600 MHz,D2O):δH7.76(1H,s,H-8),5.72(1H,d,J=6.3 Hz,H-1'),4.22(1H,dd,J=5.0,3.2 Hz,H-2'),4.07(1H,d,J=2.9 Hz,H-3'),3.71(1H,dd,J=12.8,2.7 Hz,H-4'),3.63(1H,d,J=12.8,3.5 Hz,H-5');13C NMR(150 MHz,D2O):δC157.6(s,C-6),150.9(s,C-2),139.1(s,C-4),135.8(s,C-8),115.8(s,C-5),87.6(d,C-1'),85.4(d,C-4'),73.2(d,C-2'),70.5(d,C-3'),61.3(t,C-5')。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[17]。

      苯基丙氨酸13 白色粉末;ESI-MSm/z:265[M+Na]+.1H NMR(600 MHz,D2O):δH7.23(2H,m,H-3',5'),7.18(1H,m,H-4'),7.13(2H,m,H-2',6'),3.72(1H,m,H-2),3.04(1H,m,H-3),2.89(1H,m,H-3);13C NMR(150 MHz,D2O):δC174.7(s,C-1),137.6(s,C-1'),130.6(d,C-3',5'),130.1(d,C-2',6'),128.5(d,C-4'),57.8(d,C-2),38.8(t,C-3)。以上數(shù)值與文獻(xiàn)數(shù)值相符[18]。

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