鄧小軍 綜述 王丹 審校

(解放軍福州總醫(yī)院輸血科，福建福州350025)

2003年，人類基因組計劃宣布完成后，生命科學(xué)的研究重心從揭示生命的遺傳信息轉(zhuǎn)移到了整體水平上功能的研究。蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，因此，對蛋白質(zhì)功能的研究成為前沿?zé)狳c，與基因組學(xué)相對應(yīng)，蛋白質(zhì)組學(xué)的概念在1994年的第一屆錫耶納會議上，由Marc Wilkins和他的導(dǎo)師Keith Williams提出，并開始得到廣泛應(yīng)用。

在上世紀(jì)80年代末90年代初，就已經(jīng)有了蛋白質(zhì)分析和表達譜鑒定技術(shù)［1-2］在各個領(lǐng)域的應(yīng)用研究，在蛋白質(zhì)組學(xué)概念提出之后，各種關(guān)于蛋白質(zhì)樣本制備技術(shù)、鑒定技術(shù)、定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、蛋白成像技術(shù)等發(fā)展迅猛，一些新興學(xué)科和其他領(lǐng)域的技術(shù)方法也在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到深入應(yīng)用，如生物信息學(xué)技術(shù)、芯片技術(shù)等。

輸血醫(yī)學(xué)在最近數(shù)十年也得到長足發(fā)展，成為一門獨立臨床學(xué)科，其發(fā)展進程得益于各種新技術(shù)、新方法在輸血領(lǐng)域的普及應(yīng)用。盡管在血型鑒定及基因分型、血液制品安全、輸血性疾病的篩查等方面都已經(jīng)取得較好的進展，但由于血液成分的多樣性和復(fù)雜性以及輸血免疫的復(fù)雜性，尚有很多問題未能得到很好的解決，一些未知的領(lǐng)域也需要采用新的手段和方法來探索，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為我們提供了一條新的途徑［3］。

臨床上常用血液制品主要有3種，包括紅細胞濃縮物、血小板濃縮物和血漿蛋白制品，粒細胞的采集則相對較少，主要用于粒細胞缺乏癥的患者以預(yù)防感染性并發(fā)癥。近年來，輸血醫(yī)學(xué)的概念還拓展涵蓋了造血干細胞的自體和異體移植。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為輸血醫(yī)學(xué)研究提供了新的視野以及新的研究平臺和手段，并已取得了一系列令人矚目的進展。

一、血漿蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組學(xué)在發(fā)展過程中，首先就是從血漿開始著手。其主要原因在于最開始，人們嘗試通過血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究找尋潛在的疾病標(biāo)志物［4］。在樣本制備方面，血漿也具有獨特的優(yōu)勢。

盡管血漿蛋白質(zhì)組研究進展飛速，并取得廣泛應(yīng)用和巨大成果，然而在很長一段時間，血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的研究并未應(yīng)用到輸血領(lǐng)域。最初蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在血液衍生品治療方面的應(yīng)用，是在2006年由Brigulla等［5］通過雙向凝膠電泳以及質(zhì)譜技術(shù)測定血漿凝血酶原復(fù)合濃縮物與常規(guī)血漿質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)的差異，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來評價凝血酶原復(fù)合物在輸血治療方面的應(yīng)用價值。通過該研究發(fā)現(xiàn)了40種不同的蛋白質(zhì)，其中一些可能是參與凝血因子濃度調(diào)控的潛在修飾蛋白。隨后，Clifton等［6］采用比較串聯(lián)質(zhì)譜的方法對3種不同商業(yè)應(yīng)用的Ⅷ因子/血管性血友病因子(vWF)進行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在不同產(chǎn)品之間，發(fā)現(xiàn)其中除了主要成分之外，發(fā)現(xiàn)了一些其他具有明顯差異的血漿蛋白成分，如凝血酶原等添加物。對同一產(chǎn)品不同批次之間的差異的研究，顯示出蛋白組學(xué)技術(shù)在質(zhì)量控制方面的應(yīng)用價值。同樣是該研究小組，在2010年，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對Ⅸ因子分離全過程進行監(jiān)控和評價［7］。針對不同階段可能殘留的大分子蛋白，利用液相串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)檢測其殘留量，用于目標(biāo)蛋白的快速鑒定、生產(chǎn)流程優(yōu)化等。更進一步的研究，各種血漿補體因子、簇連蛋白等多種成分相繼得到確認(rèn)。采用常規(guī)方法檢測血漿凝血因子，常常用活性來表示其濃度，由于蛋白質(zhì)組學(xué)研究檢測的是蛋白量，因此，也可以用來評估不具活性的凝血因子含量［5］。盡管目前在輸血領(lǐng)域僅有少量的蛋白質(zhì)組方面的研究，但是通過這些研究，可能找出一些潛在的修飾過的凝血因子或其他低含量物質(zhì)，而往往這些物質(zhì)的存在在輸血過程中很可能會影響血制品的免疫原性，從而產(chǎn)生輸血反應(yīng)。

2002年國際人類蛋白質(zhì)組組織(human proteome organization，HUPO)將血漿蛋白質(zhì)組作為首期執(zhí)行計劃以來，到目前為止，應(yīng)用于輸血治療目的的研究還非常少［8］，較為突出的研究是用來評價不同儲存條件和時間下，新鮮冰凍血漿各種凝血因子水平和活性的研究［9-11］。在不同方式處理的血液制品中，很可能存在一些蛋白質(zhì)修飾，這些改變是否對于血制品輸注產(chǎn)生影響，有待評價。而這些修飾后蛋白，很難用常規(guī)技術(shù)進行鑒定，蛋白質(zhì)組學(xué)則顯示出其優(yōu)勢。在亞甲藍處理血漿中，就顯示出了γ纖維蛋白原、視黃醇攜帶蛋白、載脂蛋白 AI等發(fā)生翻譯后修飾現(xiàn)象［12］，而在相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)，含溶媒和去污劑的混合血漿中，利用蛋白質(zhì)組技術(shù)發(fā)現(xiàn)了α1抗胰蛋白酶、α1抗胰凝乳蛋白酶以及α2抗纖維蛋白溶解酶的改變［8］。這些研究提示，在進行血液制品去病原體技術(shù)開發(fā)以及應(yīng)用時，可能需要考慮到蛋白組學(xué)方面的改變。

二、紅細胞蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究在一些紅細胞疾病如鐮刀形紅細胞貧血中已經(jīng)得到廣泛且成功的應(yīng)用，對于紅細胞儲存損傷的體外蛋白質(zhì)組研究也已經(jīng)開展。紅細胞儲存損傷通常通過ATP、2，3-二磷酸甘油酸(2，3-DPG)、細胞形態(tài)和攜氧能力等進行評價，而在蛋白質(zhì)組學(xué)進入該研究領(lǐng)域后，對于損傷機制有了更加深入的了解。Anniss等［13］比較了去白和保留白細胞的不同紅細胞懸液上清蛋白質(zhì)組，Bosman［14］對紅細胞體內(nèi)和體外衰老過程中蛋白質(zhì)組學(xué)變化進行了比較，而在紅細胞保存損傷研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)還應(yīng)用到了細胞膜、囊泡、微粒等研究［15-17］。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的更深入研究表明，細胞損傷很可能是由于引發(fā)了識別衰老細胞的抗體的自然產(chǎn)生［18］，紅細胞儲存過程中產(chǎn)生的變化可能較之前想象的要精密且復(fù)雜得多。蛋白質(zhì)組研究顯示，隨著時間推移，一些具有生理學(xué)功能蛋白開始降解，與此同時，一些蛋白則在細胞中的定位發(fā)生改變，這種變化可能也與細胞損傷、衰老或死亡相關(guān)，迄今已發(fā)現(xiàn)一些應(yīng)激蛋白、蛋白酶體及伴侶蛋白在紅細胞保存期間發(fā)生顯著變化。蛋白質(zhì)組技術(shù)也被應(yīng)用于衰老細胞輸注產(chǎn)生不良反應(yīng)的研究中。在紅細胞蛋白質(zhì)組相關(guān)研究中，有望在微泡形成、氧化損傷、紅細胞清除等方面建立研究模型和假說。同時，還有可能發(fā)現(xiàn)紅細胞衰老/破壞新的標(biāo)志物，從而對紅細胞制品進行更好質(zhì)量控制，甚至有望達到實時監(jiān)控。

三、血小板蛋白質(zhì)組

蛋白質(zhì)組學(xué)在血小板研究中的首次應(yīng)用，并非用來評價輸注血液制品，而是用于研究新鮮血小板的活性。自2007年以來，多個研究小組開始對保存血小板蛋白質(zhì)組變化進行研究。Power等［19］創(chuàng)造性地采用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在血小板剪接變異體檢測方面提供了新的途徑。關(guān)于血小板蛋白質(zhì)組研究，已經(jīng)有了專門的資源庫［20］，Dittrich［21］等則首次對血小板蛋白質(zhì)組的交互作用網(wǎng)絡(luò)、信號肽分子、磷酸化等進行了描繪。幾乎所有關(guān)于血小板蛋白質(zhì)組研究證實，不同來源以及不同保存方式下的血小板在蛋白表達譜上確有變化，盡管由于實驗設(shè)計及蛋白質(zhì)組研究方法的不同導(dǎo)致觀察到的這些變化也有所不同。但總體而言，這些蛋白和血小板激活以及相關(guān)信號通路相關(guān)［22］。近期關(guān)于血小板的蛋白組學(xué)研究提示，一些發(fā)現(xiàn)可能與輸血相關(guān)，比如Peter［23］和 Schulz［24］在同期 blood 上發(fā)表的文章顯示，他們通過不同蛋白組學(xué)方法研究確定了新的通過糖蛋白VI誘導(dǎo)血小板活化的信號系統(tǒng)。

由于血小板特殊的生理特性而難以保存，加之人類尚未發(fā)明成功血小板代用品，血小板有效保存問題，一直是國際輸血工作者研究的熱點和難點。對血小板保存的蛋白組學(xué)的深入研究，則有可能能改善血小板保存損傷，從而延長血小板保存期限，提升輸注效果。

四、展望

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為我們提供大量的數(shù)據(jù)和信息，同時也為研究帶來困擾。如何通過海量信息找尋隱藏其中的奧秘，需要我們不斷挖掘，在輸血領(lǐng)域的應(yīng)用亦是如此。在血制品方面，通過蛋白組學(xué)的研究，將為血制品制作過程、保存期間變化、個體獻血者對血制品質(zhì)量的影響等方面提供更為獨特的視角;在獻血員篩查與管理、血液安全等方面，由于蛋白組學(xué)研究能夠提供新的更靈敏的血液標(biāo)志物，將使得我們對于獻血員情況實施更好的掌握;通過不同蛋白標(biāo)記物可以建立獻血員蛋白譜，從而優(yōu)化成分血制品效率;在受血方而言，蛋白組學(xué)研究將能夠通過特定蛋白標(biāo)志降低輸血風(fēng)險如輸血相關(guān)性急性肺損傷(TRALI)或非溶血性輸血反應(yīng)的產(chǎn)生。

同時，蛋白質(zhì)組學(xué)在輸血醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，為合作研究提供機會。對于單獨的研究小組而言，蛋白組學(xué)的研究非常昂貴，而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量也很難在短時間內(nèi)得到充分的挖掘。大型聯(lián)合研究將發(fā)揮蛋白質(zhì)組學(xué)的充分優(yōu)勢，極大化地利用產(chǎn)出數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)為輸血醫(yī)學(xué)研究提供了有力的武器，而隨著蛋白質(zhì)組學(xué)自身的不斷發(fā)展，也將在輸血領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，輸血醫(yī)學(xué)更加美好的前景值得期待!

［1］金宏偉，曾新華，黃河清.蛋白質(zhì)組技術(shù)研究人血清功能蛋白質(zhì)的新進展［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2008，23(3):327-330.

［2］Williams KL，Gooley AA，Haynes PA，et al.Analyticalbiotechnology:applications fordownstream processing［J］.Aust J Biotechnol，1991，5(2):96-100.

［3］Reddy KS，Perrotta PL.Proteomics in transfusion medicine［J］.Transfusion，2004，44(4):601-604.

［4］賈克剛，劉軍鋒，劉運德.蛋白質(zhì)組及其在心血管系統(tǒng)的研究進展［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2007，22(1):88-90.

［5］Brigulla M，Thiele T，Scharf C，et al.Proteomics as a tool for assessment of therapeutics in transfusion medicine:evaluation of prothrombin complex concentrates［J］.Transfusion，2006，46(3):377-385.

［6］Clifton JG，Huang F，Kovac S，et al.Proteomic characterization of plasma-derived clotting factorⅧ-von Willebrand factor concentrates［J］.Electrophoresis，2009，30(20):3636-3646.

［7］Clifton J，Huang F，Gaso-Sokac D，et al.Use of proteomics for validation of the isolation process of clotting factor Ⅸ from human plasma［J］.J Proteomics，2010，73(3):678-688.

［8］Steil L，Thiele T，Hammer E，et al.Proteomic characterization of freeze-dried human plasma:providing treatment of bleeding disorders without the need for a cold chain［J］.Transfusion，2008，48(11):2356-2363.

［9］Sidhu RS，Le T，Brimhall B，et al.Study of coagulation factor activities in apheresed thawed fresh frozen plasma at 1-6 degrees C for five days［J］.J Clin Apher，2006，21(4):224-226.

［10］Yazer MH，Cortese-Hassett A，Triulzi DJ.Coagulation factor levels in plasma frozen within 24 hours of phlebotomy over 5 days of storage at 1 to 6 degrees C［J］.Transfusion，2008，48(12):2525-2530.

［11］Von Heymann C，Keller MK，Spies C，et al.Activity of clotting factors in fresh-frozen plasmaduring storage at 4 degrees C over 6 days［J］.Transfusion，2009，49(5):913-920.

［12］Crettaz D，Sensebe L，Vu DH，et al.Proteomics of methylene blue photo-treated plasma before and after removal of the dye by an absorbent filter［J］.Proteomics，2004，4(3):881-891.

［13］Anniss AM，Glenister KM，Killian JJ，et al.Proteomic analysis of supernatants of stored red blood cell products［J］.Transfusion，2005，45(9):1426-1433.

［14］Bosman GJ，Lasonder E，Groenen-D?pp YA，et al.Comparative proteomics of erythrocyte aging in vivo and in vitro［J］.J Proteomics，2010，73(3):396-402.

［15］Bosman GJ，Lasonder E，Luten M，et al.The proteome of red cell membranes and vesicles during storage in blood bank conditions［J］.Transfusion，2008，48(5):827-835.

［16］D'Amici GM，Rinalducci S，Zolla L.Proteomic analysis of RBC membrane protein degradation during blood storage［J］.J Proteome Res，2007，6(8):3242-3255.

［17］Rubin O，Crettaz D，Canellini G，et al.Microparticles in stored red blood cells:an approach using flow cytometry and proteomic tools［J］.Vox Sang，2008，95(4):288-297.

［18］Bosman GJ，Stappers M，Novotny VM.Changes in band 3 structure asdeterminantsoferythrocyte integrity during storage and survival after transfusion［J］.Blood Transfus，2010，8(Suppl 3):s48-s52.

［19］Power KA，McRedmond JP，de Stefani A，et al.High-throughput proteomics detection of novel splice isoforms in human platelets［J］.PLoS One，2009，4(3):e5001.

［20］Cagney G，McRedmond J.A central resource for platelet proteomics［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(7):1214-1215.

［21］Dittrich M，Birschmann I，Mietner S，et al.Platelet protein interactions:map，signaling components，and phosphorylation groundstate［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(7):1326-1331.

［22］Thiele T，Steil L，Gebhard S，et al.Profiling of alterations in platelet proteins during storage of platelet concentrates［J］.Transfusion，2007，47(7):1221-1233.

［23］Peter K.Proteomics unravels platelet function［J］.Blood，2010，115(20):4008-4009.

［24］Schulz C，Leuschen NV，F(xiàn)r?hlich T，et al.Identification of novel downstream targets of platelet glycoproteinⅥ activationbydifferentialproteome analysis:implications for thrombus formation［J］.Blood 2010，115(20):4102-4110.