宋 怡 (吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，吉林 長春 133000)

透明質(zhì)酸酶又名玻璃尿酸酶，現(xiàn)已被《中國藥典》收錄，稱為玻璃酸酶。上世紀(jì)五十年代末，原吉林醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院基本外科利用它能分解細(xì)胞間黏合物質(zhì)透明質(zhì)酸(玻璃酸)的作用，提出了用此酶防治術(shù)后腸粘連的研究課題。當(dāng)時國內(nèi)此酶尚無自產(chǎn)品問世，進(jìn)口量也很有限，不能滿足本課題的大量需要。因而，提制能供臨床應(yīng)用的透明質(zhì)酸酶成了開展此項研究課題的關(guān)鍵。在那個物資匱乏、學(xué)術(shù)交流停滯的年代，關(guān)于此酶的提制工藝和鑒定方法都無完整的資料可循，一切都須因陋就簡、自力更生來設(shè)計實(shí)施。本研究分三個部分，即提制、鑒定和臨床應(yīng)用。

1 透明質(zhì)酸酶的提制

本研究采用牛睪丸作為原料，研究過程中的所有步驟皆在4℃以下進(jìn)行。將冷凍的牛睪丸去除包膜，將細(xì)精管研磨成勻漿，加等體積濃度為0.1 mol/L的醋酸溶液，浸出兩次，12 h/次，并時加攪動。收集上清液，按每升加212 g之比例向上清液中緩緩加入硫酸銨，邊加邊快速攪動。收集沉淀。如向上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至其濃度達(dá)282 g/L，則仍有部分含酶沉淀析出。合并兩次收集之沉淀，加蒸餾水至全溶為限。然后移至透析袋內(nèi)，流水透析，以便將袋內(nèi)液體中的無機(jī)鹽去掉。收集袋中含酶的液體，凍干后，以本研究第二部分之方法鑒定。

按此工藝過程，共提取了27批制品，其中92%含酶量在每毫克300單位以上，皆可達(dá)到作為商品的質(zhì)量要求。進(jìn)一步精制，可將袋內(nèi)液體移至容器中，按其體積的1/3緩緩加入95%的乙醇，并不斷攪動。收集沉淀，加pH=6.5的McIlvaine緩沖液(含氯化鈉0.28%)至其全溶為限。將溶液置于透析袋內(nèi)，浸于蒸餾水中透析。收集袋中上清液，凍干后鑒定，則可得含酶量在每毫克550～600單位的精制品。精制后雖酶的含量增加，但收獲量較低，不宜于生產(chǎn);只作為中央藥檢所委托生產(chǎn)的鑒定用的標(biāo)準(zhǔn)品。

所有各批制品，皆做了酪氨酸含量檢查，結(jié)果以一個單位中的微克數(shù)(μg/單位)來表示，皆在 0.3 ～0.7 μg/單位之間，只有一批精制品為0.15μg/單位，仍高于進(jìn)口品Rodanse的含量水平(0.105 μg/單位)。本制品的結(jié)果雖差強(qiáng)人意，但對化學(xué)活性和生物活性皆未見影響。

各批產(chǎn)品經(jīng)中央藥檢所抽檢復(fù)驗，確認(rèn)其質(zhì)量合乎生產(chǎn)要求。與此同時各批產(chǎn)品皆在藥理科指導(dǎo)下做了安全試驗，未發(fā)現(xiàn)有致痛、致炎和致敏等不良作用，急性毒理試驗陰性，細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)均無生長，pH在5.8～7.0之間。制品經(jīng)衛(wèi)生部審核，于1960年6月得到批準(zhǔn)正式生產(chǎn)，供科研及臨床需要，以補(bǔ)充進(jìn)口品之不足。

2 透明質(zhì)酸酶的鑒定

完整的透明質(zhì)酸酶鑒定應(yīng)包括化學(xué)活性鑒定(即觀察它分解底物透明質(zhì)酸的能力)和生物活性鑒定(即觀察它在生物組織間的擴(kuò)散能力)。

2.1 化學(xué)活性鑒定

2.1.1 鑒定法設(shè)計原理:是基于此酶的底物透明質(zhì)酸與顯濁劑酸化白蛋白相遇會產(chǎn)生混濁;如事先將透明質(zhì)酸酶與定量的透明質(zhì)酸混合溫育，則濁度隨酶量的增加而減低直至透明，以此來反映酶活性的大小。

2.1.2 試劑的配制:實(shí)施這一設(shè)計，必須有做對比用的標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸和顯濁用的酸化白蛋白，但當(dāng)時在市上皆無供應(yīng)，亦未見到公認(rèn)的規(guī)范鑒定法。面對這些困難，本研究采取了下述措施:①對比用的標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸酶:權(quán)且以英產(chǎn)Rondase充當(dāng)，實(shí)際就是用Rondase的單位做標(biāo)準(zhǔn)來鑒定本制品，也就是將Rondase的單位轉(zhuǎn)用于本制品。為此，首先需測出一個單位的Rondase最大能分解多少量的透明質(zhì)酸，做法是，向一系列的試管中加入不同量的透明質(zhì)酸，再向各管分別加入一個單位Rondase，經(jīng)溫浴顯濁后，濁度完全消失的管中含有的最大透明質(zhì)酸量就是一個單位Rondase所能完全分解的最大透明質(zhì)酸量;如被檢制品也能將該量透明質(zhì)酸完全分解，則其中最低含酶量必然相當(dāng)于Rondase的一個單位。本研究中用于透明質(zhì)酸酶的單位，都是Rondase的單位。本制品的化學(xué)活性，就是以每毫克制品中含酶多少單位來判定的。②透明質(zhì)酸:是本研究由人臍帶間質(zhì)中提制的。方法是將間質(zhì)用最少量的蒸餾水溶解，離心后取上清，然后用丙酮脫水而制成。③顯濁用的酸化白蛋白:本研究用酸化正常人血清代替，是用人血清加10倍的醋酸鹽緩沖液稀釋，然后用4 mol/L的鹽酸調(diào)至pH=3.10而制成。

2.1.3 鑒定的具體程序:向一系列試管中預(yù)加0.5 ml相當(dāng)于本品一個單位的透明質(zhì)酸溶液;隨即向各管中加入不同體積、同一濃度(一般用1 mg/ml)的被檢品溶液，并用pH=4.2的醋酸鹽緩沖液補(bǔ)足至1ml;置于37.5℃水浴槽中溫育30 min后，迅速加入0℃、pH=4.2的醋酸鹽緩沖液3 ml以中止反應(yīng);再向各管中加入酸化血清1 ml顯濁，用600 nm波長比濁。使?jié)岫韧耆У淖畹蜐舛鹊谋粰z品中的含酶量為該制品的一個單位。例如，加入的被檢品量為2 μl，則被檢品中含酶量為每毫克500單位。

2.2 生物活性鑒定:生物活性指透明質(zhì)酸酶在生物體中分解透明質(zhì)酸的作用。一般以人為的色素斑點(diǎn)擴(kuò)散面積的大小來表示。本研究用人血紅蛋白液作為指示劑。

有兩種鑒定方法:①簡便鑒定法:向兩側(cè)兔耳內(nèi)面皮下各注入指示劑0.1 ml，形成色點(diǎn)，然后向一側(cè)色點(diǎn)中注入含0.1單位的透明質(zhì)酸酶0.1 ml，向另側(cè)色點(diǎn)中注入0.1 ml生理鹽水作為對照，對比兩側(cè)色點(diǎn)擴(kuò)散面積。如含酶的色點(diǎn)擴(kuò)散面積大于對照色點(diǎn)，則提示被檢酶具有生物活性。本研究各批制品用此法鑒定皆顯示有生物活性。②最大擴(kuò)散力鑒定:以注入酶的色點(diǎn)不再擴(kuò)散時的酶的稀釋度來代表。做法是，將新剝兔皮內(nèi)面向上固定于38℃的木板上，向預(yù)注有指示劑的色點(diǎn)中注入0.1 ml不同稀釋度的透明質(zhì)酸酶。色點(diǎn)的擴(kuò)散面積隨酶的濃度減低而減小，當(dāng)面積與不含酶的色點(diǎn)相同時的稀釋度，即為此酶的最大擴(kuò)散力。此法適用于不同產(chǎn)品的酶活性對比，但不適于常規(guī)應(yīng)用。本制品有8批按此法做了生物活性鑒定，最大擴(kuò)散力皆大于1 024。

3 本提制品的臨床應(yīng)用研究

3.1 防治術(shù)后腸粘連:共30例，其中13例術(shù)前有粘連，用此酶后，10例未發(fā)生梗阻癥狀，有2例發(fā)生不全梗阻，經(jīng)保守療法治愈，1例因粘連而再次手術(shù)。另17例為腹部大手術(shù)后為了預(yù)防粘連而使用的，術(shù)后皆未發(fā)生梗阻癥狀。就以上觀察及武漢醫(yī)學(xué)院動物試驗之報告，此酶對防治腹腔粘連有一定效果。

3.2 促進(jìn)皮下輸液的擴(kuò)散:共用于25例患者，并用生理鹽水作為對照。結(jié)果顯示加酶后液體擴(kuò)散迅速，皮下輸液速度最快可達(dá)半小時700 ml，輸液中患者無痛感。此酶對促進(jìn)皮下液體擴(kuò)散有肯定之效果。

3.3 加速局部麻醉生效時間，擴(kuò)大局部麻醉面積:共用于14例患者，效果顯著;麻醉維持之時間短，但可加腎上腺素以糾正之。

3.4 促進(jìn)血腫消散:已用于4例患者，有3例新鮮血腫注射此酶后血腫迅速消散，另1例血腫已超過24 h，故消散較慢。結(jié)合上海醫(yī)學(xué)院之報告，此酶對促進(jìn)新鮮血腫之消散有肯定效果。

3.5 促進(jìn)漏于皮下之高滲及有刺激性藥物之消散:在門診用于2例患者(分別為氯化鈣和去甲腎上腺素)，注入此酶后，局部刺激癥狀迅速消失，皮膚免于壞死。

3.6 曾試用于檢測滑膜液中的透明質(zhì)酸，檢測方法同上述透明質(zhì)酸酶鑒定的具體程序，只是用檢品代替透明質(zhì)酸。按加入的不同量的透明質(zhì)酸酶引起的濁度改變畫成曲線，以濁度為零時最小酶量做單位，此單位與滑膜液中的透明質(zhì)酸量成正比。當(dāng)時因無標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸，未能定出滑膜液中透明質(zhì)酸的正常值，因而未形成正規(guī)的檢驗項目。

研究中所參閱的主要文獻(xiàn)

［1］Freeman Me，Anderson P，et al.Preparation of Purified Hyaluronidase from bovine testis［J］.J Biol Chem，1949，180(2):655.

［2］Colowick，et al.Method in Enzymology［M］.1:171-172 N.Y Academic Press Inc，1956.

［3］Tolksdorf S，Mccready Mh，et al.The Turbidimetric Assay of Hyaluronidase［J］.J Lab Clin Med，1949，34(1):74.

［4］Hadidian Z，Pirie NM，et al.The Preparation and Some Properties of Hyaluronic Acid from Umbilical Cord［J］.Biochem J，1948，42(2):260.