■安曉萍 王哲奇 齊景偉 于長青 陳大勇仝寶生

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古斯隆生物技術有限責任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 011517）

豆粕是動物最重要的植物性蛋白源，其蛋白含量高，且賴氨酸含量高達2.5%～2.8%，具有較平衡的氨基酸組成，因此，豆粕是目前畜牧養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的一種優(yōu)質蛋白源。但由于豆粕中的蛋白質相對分子質量較大且結構緊密，不易消化吸收，且含有胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子，使豆粕的消化率和動物的吸收率下降[1]。因此，豆粕中抗營養(yǎng)因子的消除和蛋白質的有效吸收一直是人們關注的焦點。

發(fā)酵豆粕是利用微生物發(fā)酵法處理后的豆粕，在發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)物對豆粕進行降解，不僅能有效去除豆粕中的抗營養(yǎng)因子，還能降解大分子蛋白生成多肽、小肽和氨基酸等小分子蛋白，同時豆粕中積累了大量的有益微生物，極大地改善了豆粕的蛋白品質，形成優(yōu)質的蛋白飼料[2-3]。本文通過混菌固態(tài)發(fā)酵豆粕，以降低豆粕中大分子蛋白和降低抗營養(yǎng)因子的含量，該產(chǎn)品具有多肽、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪的含量高，而粗纖維、胰蛋白酶抑制因子的含量低，是一種優(yōu)質的生物活性蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 菌種和試驗材料

枯草芽孢桿菌1.0892，米曲霉2.0951購于中國微生物菌種保藏中心；豆粕、麩皮為市購；腐植酸鈉由內(nèi)蒙古永業(yè)集團有限公司提供。

1.2 發(fā)酵方法

1.2.1 單菌發(fā)酵方法

30 g的豆粕（含1.75%的腐植酸鈉，5.83%的麩皮，0.74%的磷酸氫二鉀）裝入250 ml三角瓶中，高溫高壓滅菌作為發(fā)酵培養(yǎng)基。種子液培養(yǎng)到接種時間后按干基10%接種量即5 ml的種子液接種，先加到準備好的50 ml無菌蒸餾水中，再倒入發(fā)酵培養(yǎng)基中，用玻璃棒混合均勻后用發(fā)酵封口膜封口，放入34℃的培養(yǎng)箱發(fā)酵，發(fā)酵的時間定為48、60、72、84、96 h，每個時間點2個平行，發(fā)酵結束后放入65℃的烘箱中烘干，研磨過60目篩，放到干燥陰涼處保存待測。

1.2.2 混菌發(fā)酵方法

按比例將各種菌混合，按干基10%接種量接入發(fā)酵底物中，自然pH值，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間90 h。

1.3 營養(yǎng)成分測定方法

多肽含量為酸溶性蛋白與游離氨基酸之差。測定酸溶性蛋白的方法參照QB/T 2653-2004[4]；游離氨基酸的測定參照王志文（1988）[5]介紹的方法；粗蛋白測定參照GB/T 6432-1994介紹的凱氏定氮法[6]；粗脂肪測定參照GB/T 6433-1994介紹的索氏抽提法[7]；粗灰分測定參照GB/T 6438-1992介紹的灼燒法[8]；粗纖維測定參照GB/T 6434-1994介紹的酸堿法[9]；鈣、磷測定參照張麗英（2003）[10]介紹的方法；氨基酸的測定參照GB/T 18246-2000[11]；胰蛋白酶抑制因子的測定參照GB/T 21498-2008[12]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2007處理數(shù)據(jù)，結果以“平均值±標準差”表示；利用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單菌發(fā)酵豆粕結果

分別將枯草芽孢桿菌和米曲霉接入豆粕發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，測得不同時間發(fā)酵豆粕中多肽的含量，結果見表1。由表1可知，枯草芽孢桿菌、米曲霉發(fā)酵豆粕時，96 h的大豆多肽含量較高，但是與84 h的發(fā)酵結果相比差異并不顯著，故選擇84 h為枯草芽孢桿菌、米曲霉單菌發(fā)酵的時間點較為合適，不但大豆多肽含量較為理想，而且還可以節(jié)約時間，縮短生產(chǎn)周期。

表1 單菌發(fā)酵豆粕多肽含量的變化(%)

2.2 混合固態(tài)發(fā)酵豆粕結果（見表2）

由表2可知，枯草芽孢桿菌與米曲霉混合比例為2∶1時，發(fā)酵豆粕中多肽含量顯著高于其他兩組（P＜0.05），各組間粗蛋白含量和pH值無顯著差異。

表2 混菌發(fā)酵豆粕多肽含量的變化

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)成分的變化

2.3.1 發(fā)酵前后蛋白質及常規(guī)營養(yǎng)成分的變化（見表3）

由表3可知，發(fā)酵豆粕中多肽、粗蛋白、粗脂肪、鈣和磷的含量均顯著高于發(fā)酵前水平，分別提高了1 673.1%、27.29%、20.25%、32.50%和61.53%；而真蛋白、粗纖維和粗灰分的含量顯著低于發(fā)酵前，分別降低了13.56%、21.12%和13.58%。

表3 發(fā)酵前后豆粕營養(yǎng)成分的變化

2.3.2 氨基酸組成的變化（見表4）

由表4可知，發(fā)酵后氨基酸變化較大的有纈氨酸和蛋氨酸，其中纈氨酸含量是發(fā)酵前的3.2倍，蛋氨酸是發(fā)酵前的1.8倍，此外天門冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸，甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和脯氨酸均有一定程度的增加，而絲氨酸和精氨酸有小幅度降低，氨基酸總量提高了1.12倍。

通過對比發(fā)酵前后豆粕蛋白質中氨基酸的含量，可以看出發(fā)酵后氨基酸的種類沒有變化，總氨基酸含量有所提高，蛋氨酸是豆粕中一種主要的限制性氨基酸，發(fā)酵后提高了1.8倍，除絲氨酸和精氨酸稍有下降外其余氨基酸均有不同程度的增加。

表4 發(fā)酵前后氨基酸含量的比較(%)

2.3.3 胰蛋白酶抑制因子測定結果（見表5）

表5 發(fā)酵前后胰蛋白酶抑制因子的變化

由表5可知，發(fā)酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子顯著低于豆粕原料中的。通過對比發(fā)酵前后胰蛋白酶抑制因子的含量得到，發(fā)酵后的產(chǎn)物中胰蛋白酶抑制因子被消除了83.10%，極大地提高了利用效率。

3 討論

3.1 菌種對發(fā)酵產(chǎn)物中多肽含量的影響

國內(nèi)已有利用產(chǎn)酶較高的枯草芽孢桿菌與酵母和乳酸菌復配混合發(fā)酵豆粕制備大豆多肽的研究報道，如劉建飛[13]利用兼性厭氧的枯草芽抱桿菌NCU646與菌釀酒酵母NCU223和植物乳酸桿菌NCU116固態(tài)發(fā)酵豆粕，得到發(fā)酵后產(chǎn)物中多肽含量能達到17.01%。而僅利用米曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的報道較多。李善仁等[14]利用枯草芽孢桿菌CS27與米曲霉2∶1混合發(fā)酵，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝產(chǎn)物中多肽含量能達到21.74%，提高了5.1倍。吳寶昌[15]采用枯草芽孢桿菌1389與米曲霉2.0951以1∶1的體積混合發(fā)酵制備豆粕飼料，優(yōu)化發(fā)酵工藝后，發(fā)酵豆粕的蛋白酶酶活值在980 U/g左右，大豆肽轉化率在50%左右，高于單菌發(fā)酵的結果。本試驗結果也顯示枯草芽孢桿菌和米曲霉以2∶1的比例混合發(fā)酵豆粕，發(fā)酵豆粕中多肽含量明顯高于單菌發(fā)酵。

3.2 發(fā)酵對豆粕中蛋白質含量的影響

本試驗所選用的豆粕品質并不高，再與麩皮等物質混合后，初始粗蛋白含量僅為36.12%，顯然不能滿足動物體中的蛋白需要，經(jīng)混菌發(fā)酵后的產(chǎn)物粗蛋白含量能達到46.16%，這是因為菌體在生長過程中消耗了底物中的碳水化合物，達到了底物中蛋白濃縮的效果[16]。而由多肽含量的增加和真蛋白含量的減少可以看出，發(fā)酵后的產(chǎn)物粗蛋白組成也有了很大的變化，菌體生長代謝可以利用底物中的非蛋白氮轉化為菌體蛋白，并且菌體發(fā)酵過程中產(chǎn)生的胞外酶作用于大分子的蛋白部分轉化為多肽，提高了蛋白利用率。還有一些酶直接將蛋白水解為游離氨基酸、小肽、氨態(tài)氮造成真蛋白的減少。通過對比發(fā)酵前后蛋白質中氨基酸的含量可以看出，發(fā)酵后氨基酸的種類沒有變化，總體有較大的提高，蛋氨酸是豆粕中的第一限制性氨基酸，發(fā)酵后提高了1.8倍，除絲氨酸和精氨酸稍有下降外其余氨基酸均有不同程度的增加。馬文強等[17]通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕后得到絕大多數(shù)氨基酸的含量均有提高，并且氨基酸總量比發(fā)酵前提高了11.49%。陳中平[18]采用米曲霉發(fā)酵豆粕得到發(fā)酵后蛋氨酸的含量有顯著的增加，除賴氨酸、組氨酸、丙氨酸和纈氨酸稍有下降但是差異并不顯著。

3.3 發(fā)酵對豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

由結果得到發(fā)酵后產(chǎn)物中粗纖維顯著降低，這是由于枯草芽孢桿菌1.0892在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了纖維素酶，分解了底物中的纖維素，使纖維素含量降低；粗灰分含量的降低有可能是因為菌體在發(fā)酵過程中利用了礦物質，導致灰分含量的降低。發(fā)酵產(chǎn)物中鈣磷和粗脂肪均有增加，且差異顯著，一部分是因為菌體發(fā)酵過程中消耗了底物中碳水化合物，造成相對含量的增加，還可能是粗脂肪在微生物發(fā)酵過程中轉化而來，目前相關報道已有很多，任莉等[19]通過觀測發(fā)酵豆粕的營養(yǎng)物質得到發(fā)酵后的豆粕粗蛋白、粗脂肪和磷均有一定程度的增加，鈣相差不大，粗纖維有所降低。馬文強等[17]通過采用枯草芽孢桿菌WB117、釀酒酵母WY238和乳酸菌WL152固態(tài)混合發(fā)酵豆粕后得到，粗蛋白、粗脂肪和磷都有顯著地提高，而鈣含量稍有下降。這與本試驗研究結果稍有不同，這些差異可能是由不同菌種生長代謝方式不同導致的，但具體的機理尚不明確。

3.4 發(fā)酵對豆粕中抗營養(yǎng)因子的影響

研究表明發(fā)酵后的豆粕中胰蛋白酶抑制因子明顯下降。Feng等[20]采用米曲霉3.042發(fā)酵豆粕，發(fā)酵后豆粕中的胰蛋白酶抑制因子全部消除。馬文強等[17]采用枯草芽孢桿菌WB117、釀酒酵母WY238和乳酸菌WL152發(fā)酵豆粕后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕中的胰蛋白酶抑制因子全部降解。付弘赟等[21]通過摸索枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、植物乳酸菌和酪酸梭狀芽孢桿菌混菌發(fā)酵豆粕的條件，得到優(yōu)化后胰蛋白酶抑制因子去除率能達到60%。本試驗發(fā)現(xiàn)，通過對比發(fā)酵前后胰蛋白酶抑制因子的含量得到，發(fā)酵后的產(chǎn)物中胰蛋白酶抑制因子被消除了83%，極大地提高了利用效率，與前人研究結果一致。

4 結論

4.1 對比發(fā)酵后產(chǎn)物中多肽含量得知枯草芽孢桿菌1.0892和米曲霉2.0951以2∶1混合發(fā)酵豆粕的效果較好，此時產(chǎn)物中大豆多肽的含量達13.84%。

4.2 發(fā)酵豆粕多肽含量21.1%，粗蛋白含量46.16%，粗脂肪含量1.90%，鈣含量0.53%，磷含量0.21%，均顯著高于發(fā)酵前水平。

4.3 發(fā)酵豆粕真蛋白含量30.72%，粗纖維含量7.13%，粗灰分含量8.4%，均顯著低于底物發(fā)酵前水平。

4.4 發(fā)酵后總氨基酸含量38.33%，是發(fā)酵前總氨基酸的1.12倍。

4.5 發(fā)酵后胰蛋白酶抑制因子含量由原來的3 877.33 TUI/g下降到655.15 TUI/g。