劉小萍，王莉，吳善東

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨過(guò)敏原蛋白的效果探究

劉小萍1，王莉1，吳善東2

(1、萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西萍鄉(xiāng)337000；2、杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司，浙江杭州310052)

目的采用改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨螨體中的蛋白，提高提取液的蛋白濃度和過(guò)敏原蛋白的效價(jià)。方法(1)細(xì)胞破碎：取樣品于研缽內(nèi)，液氮反復(fù)凍融4次，每次間隔10min，在研缽內(nèi)反復(fù)研磨凍融后的樣品。(2)蛋白提取：在離心管中加入10m l Coca’s液，4℃勻速攪拌4 h后置于4℃冰箱過(guò)夜。(3)離心：4℃，5000×g離心1h，取上清液備用。(4)測(cè)提取蛋白的濃度：Bradford Reagent法測(cè)其提取蛋白的濃度。(5)SDS-PAGE電泳：參照Tricine-SDS-PAGE配制10%分離膠和4%濃縮膠，上樣10μL。(6)采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行本研究獲得的提取液與進(jìn)口戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較。結(jié)果本研究中戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取液的蛋白濃度為3.0mg/ml，遠(yuǎn)高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品的0.35mg/m l；且電泳圖顯示包含分子量為25kDa、14kDa的戶塵螨主要過(guò)敏原蛋白Der p 1、Der p 2條帶，蛋白濃度也高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品相應(yīng)的條帶；功能性實(shí)驗(yàn)中也表明本研究中戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取液的免疫效價(jià)也顯著高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。結(jié)論可以用本研究的方法來(lái)大量提取戶塵螨過(guò)敏原蛋白，提取液可替代進(jìn)口產(chǎn)品，用作戶塵螨過(guò)敏原檢測(cè)試劑的生產(chǎn)原料或用于戶塵螨過(guò)敏原皮試、點(diǎn)刺及脫敏治療等，降低這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，進(jìn)而降低國(guó)內(nèi)戶塵螨過(guò)敏的診療費(fèi)用。

塵螨；提取方法；過(guò)敏原；ELISA

過(guò)敏性疾病(變態(tài)反應(yīng)疾病)被世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)為是當(dāng)今世界性的重大衛(wèi)生問(wèn)題。引發(fā)過(guò)敏性疾病是由于人體吸入、食入或接觸過(guò)敏原引起的，常見(jiàn)過(guò)敏多是I型超敏反應(yīng)，而引起I型超敏反應(yīng)的過(guò)敏原多為自然環(huán)境的蛋白質(zhì)[1]，其中，塵螨[2，3]是最常見(jiàn)的過(guò)敏原之一，塵螨引起的過(guò)敏性疾病占80%左右。在人們生活的環(huán)境中，塵螨幾乎無(wú)處不在，嚴(yán)重影響了塵螨致敏人群的生活質(zhì)量。因此，塵螨過(guò)敏的診斷和治療也變得尤為重要。除典型的臨床癥狀之外，查找過(guò)敏原是過(guò)敏性疾病治療和預(yù)防的關(guān)鍵，過(guò)敏原測(cè)定能夠幫助醫(yī)生確定患者出現(xiàn)的情況是否由過(guò)敏引起，同時(shí)確定是由何種過(guò)敏原引起的[4]。戶塵螨過(guò)敏的診斷方法主要有皮膚試驗(yàn)和體外試驗(yàn)兩種，皮膚試驗(yàn)的方法主要是點(diǎn)刺試驗(yàn)和皮內(nèi)試驗(yàn)，體外試驗(yàn)即是用體外診斷試劑檢測(cè)血液中的塵螨過(guò)敏原特異性抗體。脫敏治療則是戶塵螨過(guò)敏治療手段中最常用的方法之一。上述戶塵螨過(guò)敏的診斷和治療方法中均要用到戶塵螨過(guò)敏原蛋白作為免疫抗原。目前市面上質(zhì)量較好的戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品主要是以美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品、德國(guó)默克公司產(chǎn)品為代表的進(jìn)口產(chǎn)品，本文采用改進(jìn)的Coca’s液[5]提取戶塵螨螨體中的過(guò)敏原蛋白，以期能替代進(jìn)口產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備戶塵螨螨體(美國(guó)GREER公司)。碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、EDTA、DIECA。Uinco UV-2100型紫外分光光度計(jì)。美國(guó)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)。普朗DNM-9602酶標(biāo)分析儀。改進(jìn)的Coca’s液(自制)。美國(guó)ALLERMED Dust Mite Extracts(Dermatophagoides pteronyssinus 5000 AU/ m l)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞破碎取1g戶塵螨螨體，放入研缽中，加入液氮使液氮液面沒(méi)過(guò)樣品，在液氮揮發(fā)后，將樣品置于室溫10min，再次加入液氮，反復(fù)凍融4次。在研缽內(nèi)反復(fù)研磨凍融后的樣品，時(shí)間約10min。

1.2.2 蛋白提取將研磨后的樣品置于50m l離心管中，加入10ml改進(jìn)的Coca’s液(0.1M Na2CO3/ NaHCO3，0.1M NaCl，2mM EDTA，20mM DIECA，pH8.2)，加入磁懸浮粒子后，在4℃條件下勻速攪拌4 h后置于4℃冰箱過(guò)夜。

1.2.3 離心取出過(guò)夜的樣品，混勻后分裝于兩管10m l離心管中，平衡后在4℃，15000×g離心1h，取上清液備用。

1.2.4 測(cè)提取蛋白的濃度配制1ml Bradford Reagent+100μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+ 10μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+5μl蛋白上清液，1m l Bradford Reagent+2μl蛋白上清液，其濃度分別代表原液，稀釋10倍、稀釋20倍、稀釋50倍。在紫外分光光度計(jì)595nm測(cè)其濃度。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)參照Tricine-SDS-PAGE配制10%分離膠和4%濃縮膠。10μl樣品+10μl loading buffer(2×)，混勻后加熱煮沸5min，冰上冷卻2min，外部加正極buffer，膠之間加負(fù)極buffer，上樣10～20μl，30V至染料進(jìn)入分離膠，改為90V至終點(diǎn)?？捡R斯亮藍(lán)工作液染色30min后用脫色液脫色至背景干凈。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照、分析。

1.2.6 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行本研究獲得的提取液與進(jìn)口戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較用本研究獲得的戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取液和美國(guó)ALLERMED公司戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品以同樣的濃度0.5μg/m l、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ m l分別包被酶標(biāo)板，在上述包被的板孔中分別每孔加入陽(yáng)性血清50μl，輕輕混勻后37℃溫育45min，洗滌5次拍干，每孔加酶聯(lián)結(jié)合物100μl，置37℃溫育45min，洗滌5次后拍干，每孔加底物顯色液100μl，37℃顯色15min后加100μl終止液終止反應(yīng)，使用標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)每孔的OD值。

2 結(jié)果

2.1 戶塵螨過(guò)敏原蛋白濃度本研究用改進(jìn)的Coca’s液提取的戶塵螨過(guò)敏原蛋白濃度為3.0 mg/ m l，而美國(guó)ALLERMED公司生產(chǎn)的過(guò)敏原蛋白濃度為0.35mg/ml，可見(jiàn)本研究所得蛋白濃度約為美國(guó)ALLERMED的9倍。

2.2 戶塵螨過(guò)敏原蛋白電泳結(jié)果本研究獲得的戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取液和美國(guó)ALLERMED公司的戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示，可以看出兩種過(guò)敏原蛋白提取液中均含有25kDa、14kDa的戶塵螨主要過(guò)敏原蛋白Der p 1、Der p 2條帶，且本研究獲得的戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取液中的各分子量的戶塵螨過(guò)敏原蛋白濃度高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。

圖1 戶塵螨過(guò)敏原蛋白SDS-PAGE

2.3 本研究獲得的提取液與進(jìn)口過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品的功能性比較本研究獲得的戶塵螨過(guò)敏原蛋白和美國(guó)ALLERMED戶塵螨過(guò)敏原蛋白以相同的濃度包被酶標(biāo)板后進(jìn)行同步ELISA試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，可見(jiàn)本研究的提取物效價(jià)明顯高于美國(guó)ALLERMED公司產(chǎn)品。

表1 戶塵螨過(guò)敏原提取液的功能比較

3 討論

戶塵螨過(guò)敏原蛋白提取的方法有很多[6]，例如傳統(tǒng)的Coca’s液、PBS提取液、裂解液及Trizol試劑等。本研究利用改進(jìn)的Coca’s液提取戶塵螨螨體的過(guò)敏原蛋白，經(jīng)與美國(guó)ALLERMED公司的戶塵螨過(guò)敏原蛋白產(chǎn)品比較，獲得的提取液蛋白濃度較高，包含戶塵螨主要過(guò)敏原蛋白組分，且比購(gòu)買的戶塵螨過(guò)敏原蛋白效價(jià)更高，因此，可以用本研究的方法來(lái)大量提取戶塵螨過(guò)敏原蛋白，提取液可替代進(jìn)口產(chǎn)品，用作為戶塵螨過(guò)敏原檢測(cè)試劑的生產(chǎn)原料或用于戶塵螨過(guò)敏原皮試、點(diǎn)刺及脫敏治療等，降低這些產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，進(jìn)而降低國(guó)內(nèi)戶塵螨過(guò)敏的診療費(fèi)用。

[1]于國(guó)芳,譚立明,李華,等.吸入性變應(yīng)原檢測(cè)對(duì)診斷過(guò)敏性疾病的臨床應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):230-232.

[2]孫勁旅,張宏譽(yù),陳軍,等.塵螨與過(guò)敏性疾病的研究進(jìn)展[J].北京醫(yī)學(xué),2004,26(3):199-201.

[3]羅臣,肖小芹.塵螨引起的疾病及其防治研究進(jìn)展[J].湖南中藥學(xué)導(dǎo)報(bào),2004,10(9):61-62.

[4]黃凱,柯江維,王曄.南昌地區(qū)兒童過(guò)敏原IgE抗體體外檢測(cè)結(jié)果與分析[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(3):291-293.

[5]Hauck PR,Williamson S.The manufacture of allergenic extracts in North America[J].Clin Rev Allergy Immunol,2001,2(1):93-110.

[6]孫勁旅,張宏譽(yù),應(yīng)萬(wàn)濤,等.利用雙向電泳比較3種提取戶塵螨蛋白的方法[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2004,24(3):321-326.

R392.8,R593.1,R446.62

A

1674-1129(2013)05-0454-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.05.019

江西省萍鄉(xiāng)市科技局資助課題(編號(hào)：萍科字2011-58)

劉小萍，女，1966年12月生，大學(xué)本科學(xué)歷，學(xué)士學(xué)位，主管技師，主攻臨床免疫學(xué)。