申?yáng)|方 張麗偉 宋榮蓉

多奈哌齊對(duì)側(cè)腦室注射鏈脲菌素致癡呆大鼠的治療作用

申?yáng)|方 張麗偉 宋榮蓉

目的研究多奈哌齊對(duì)腦室注射鏈脲菌素（STZ）致癡呆大鼠的治療作用。方法健康SD雄性大鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、多奈哌齊治療組，每組8只。模型組和治療組在手術(shù)的第1天和第3天分別向兩側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射STZ 3 mg/kg，對(duì)照組給予相同體積的檸檬酸緩沖液。多奈哌齊治療組于手術(shù)前10 d給予多奈哌齊0.45mg/（kg·d）灌胃，術(shù)后持續(xù)8周，其余2組給予等量生理鹽水。術(shù)后第10天、第8周行Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。術(shù)后8周處死大鼠取海馬送電鏡觀察神經(jīng)元凋亡情況。結(jié)果術(shù)后10 d水迷宮測(cè)試，與對(duì)照組比較，模型組與治療組的潛伏期延長(zhǎng)，過平臺(tái)次數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。術(shù)后治療8周，與模型組比較，治療組的潛伏期縮短，過平臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。電鏡下觀察多奈哌齊治療組大鼠海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡程度輕。結(jié)論側(cè)腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型穩(wěn)定性高，多奈哌齊通過減輕AD模型鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用。

阿爾茨海默?。绘滊寰?；多奈哌齊；神經(jīng)元凋亡

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是癡呆最常見的原因。其發(fā)病機(jī)制至今仍不十分清楚。腦內(nèi)乙酰膽堿水平的降低可能是AD發(fā)生的機(jī)制之一［1］，抗膽堿酯酶藥物多奈哌齊用于治療AD病人，已被證明有效。鏈脲菌素（STZ）是一種烷基化物，大鼠腦室內(nèi)小劑量注射STZ可被作為散發(fā)性AD的模型應(yīng)用［2?3］。大量的臨床研究表明，神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與AD的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過腦室注射STZ制作大鼠AD模型并應(yīng)用多奈哌齊進(jìn)行干預(yù)治療，以探討多奈哌齊對(duì)AD臨床癥狀的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD雄性大鼠24只，2.5～3月齡，體質(zhì)量200～250 g。由北京通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、多奈哌齊治療組，每組8只。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 多奈哌齊（法國(guó)PFIZEK· PGM公司），STZ（美國(guó)sigma公司），10％水合氯醛，枸櫞酸鈉溶液（武漢博士德生物工程有限公司），Morris水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），大鼠立體定位儀（江西醫(yī)療器械研究所）。

1.3 模型制作方法

1.3.1 動(dòng)物的篩選與分組：在實(shí)驗(yàn)前先將動(dòng)物進(jìn)行水迷宮初篩，測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)與記憶的獲取能力。按照Morris方法實(shí)驗(yàn)分為兩部分：（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：共歷時(shí)5 d，每天上、下午各訓(xùn)練1次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選取一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)所需的時(shí)間（即潛伏期），每次訓(xùn)練時(shí)間為60 s。如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期記為60 s，每次訓(xùn)練后讓其在平臺(tái)上停留15 s。（2）空間搜索實(shí)驗(yàn)：在第6天撤除水下平臺(tái)，隨機(jī)選取一個(gè)入水點(diǎn)，在同一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在60 s內(nèi)跨過原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)和第1次通過平臺(tái)的時(shí)間。通過初篩，去除先天癡呆（潛伏期平均值＞50 s）和游泳姿勢(shì)不良者，將24只合格大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和多奈哌齊治療組，每組各8只。

1.3.2 動(dòng)物模型的制作：水迷宮測(cè)試后48 h，SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，參考《大鼠腦立體定向圖譜Ⅲ》［4］，將大鼠的頭固定于立體定位儀上，剪去局部毛發(fā)，消毒后沿矢狀線切開皮膚，切口長(zhǎng)約1.5 cm，將骨膜向兩側(cè)推開暴露顱骨，在前囟后1.5 mm、矢狀縫側(cè)方1.5 mm處鉆孔，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)入，深度距離腦表面3.5 mm，將STZ緩慢注入模型組及多奈哌齊治療組大鼠。STZ溶于檸檬酸緩沖液中（pH 4.4），在手術(shù)的第1天和第3天分別向兩側(cè)側(cè)腦室內(nèi)注射，每次每側(cè)注入約10μl（3 mg/kg）左右。對(duì)照組大鼠給予相同體積的檸檬酸緩沖液腦室內(nèi)注射。每側(cè)注入時(shí)間為5 min，留針5 min，緩慢出針。無菌骨蠟封閉鉆孔，術(shù)區(qū)滴慶大霉素，縫合消毒。術(shù)后大鼠除給予普通飼料及自來水喂養(yǎng)外，牛奶灌胃4 d，青霉素肌注每日1次共5 d以防止感染。

1.3.3 各組大鼠的處置：多奈哌齊治療組大鼠于手術(shù)前給予多奈哌齊0.45 mg/（kg·d）灌胃10 d，于側(cè)腦室注射STZ術(shù)后再持續(xù)多奈哌齊灌胃治療8周。對(duì)照組大鼠于手術(shù)前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側(cè)腦室注射與治療組等量檸檬酸平衡液，術(shù)后再持續(xù)生理鹽水灌胃8周。模型組大鼠于手術(shù)前給予與治療組等量生理鹽水灌胃10 d。于側(cè)腦室注射STZ后再持續(xù)生理鹽水灌胃8周。

1.3.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力觀察：分別于術(shù)后第10天、第8周進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1.3.5 海馬神經(jīng)元凋亡檢測(cè)：術(shù)后第8周處死大鼠取腦海馬部位，送電鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況。電鏡用固定液（本校電鏡室提供）固定過夜，PBS漂洗，丙酮脫水，1％四氧鋨酸后固定，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察。PBS漂洗2次，2.5％的戊二醛固定后送哈爾濱醫(yī)科大學(xué)電鏡室觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦室內(nèi)注射STZ后大鼠的一般情況 注射STZ后所有動(dòng)物的體質(zhì)量均較術(shù)前減輕，毛色發(fā)暗，不整齊，趨避力減弱。個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)躁狂、抽搐等情況。術(shù)后48 h存活的大鼠絕大多數(shù)恢復(fù)正常。

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的變化 術(shù)前對(duì)照組、模型組、多奈哌齊治療組的潛伏期、過平臺(tái)次數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。術(shù)后第10天，模型組、多奈哌齊治療組潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）。過平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組比較顯著減少（P＜0.01）。術(shù)后給予藥物治療8周，多奈哌齊治療組的潛伏期與模型組比較，顯著縮短（P＜0.01），過平臺(tái)次數(shù)顯著增多（P＜0.01）。見表1，2。

表1 不同時(shí)期大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期（±s，s，n＝8）

表1 不同時(shí)期大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)潛伏期（±s，s，n＝8）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 術(shù)前 術(shù)后第10天 術(shù)后第8周對(duì)照組 17.37±9.10 16.30±5.35 17.08±7.31模型組 18.63±7.93 50.25±3.21??49.65±6.81治療組 18.18±7.93 48.60±8.21??26.10±9.50△△

表2 3組大鼠過平臺(tái)次數(shù)比較（±s，n＝8）

表2 3組大鼠過平臺(tái)次數(shù)比較（±s，n＝8）

注：與對(duì)照組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 術(shù)前 術(shù)后第10天 術(shù)后第8周對(duì)照組 3.10±1.52 2.74±1.21 3.10±1.63模型組 3.20±0.99 0.70±0.32?? 0.96±0.20治療組 2.90±1.13 0.75±0.38?? 3.01±1.38△△

2.3 細(xì)胞學(xué)改變 模型組海馬細(xì)胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體嵴斷裂或空泡變，核周板層體崩解形成髓樣變，其他細(xì)胞器消失。多奈哌齊治療組表面微絨毛豐富，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和膜結(jié)構(gòu)完好，胞質(zhì)、核周板層體豐富，結(jié)構(gòu)完整（圖1）。

圖1 模型組與治療組海馬細(xì)胞學(xué)改變（×2550）

3 討論

AD是一種主要在老年期發(fā)生的以進(jìn)行性智能衰退為主要特征的神經(jīng)元退變性疾病，主要表現(xiàn)為持續(xù)進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙而無緩解、記憶力衰退、性格和行為改變等。其病理特征為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細(xì)胞空泡變性及神經(jīng)元缺失。AD病因迄今不明。大量研究表明，腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)受體在AD發(fā)病中起著重要的作用［5］。隨著神經(jīng)元的缺失，各種神經(jīng)遞質(zhì)也隨之缺乏，其中最早也最明顯的是乙酰膽堿。膽堿能受體除與大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能有關(guān)外，還具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用［6］。隨著疾病逐步發(fā)展，AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平迅速下降。但其降低的原因還未完全闡明。由于大量的神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致大腦皮層出現(xiàn)萎縮。大體病理可見腦溝變寬，腦回變窄，腦室擴(kuò)大。鏡下可見老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元減少等主要病理學(xué)特征。

多奈哌齊是一種具有高度選擇性、可逆性的膽堿酯酶抑制劑，通過抑制膽堿酯酶而抑制乙酰膽堿降解并提高活性，改善神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞功能。大量研究顯示，多奈哌齊能改善AD病人的膽堿能系統(tǒng)功能，提高認(rèn)知能力［7］。

在人體進(jìn)行AD研究有很多局限性，因此，建立可靠穩(wěn)定的動(dòng)物模型具有重要意義。STZ對(duì)機(jī)體組織毒性相對(duì)較小，動(dòng)物存活率高，是目前國(guó)內(nèi)外使用較多的制備糖尿病動(dòng)物模型的方法。小劑量STZ側(cè)腦室注射可以制備癡呆模型，卻未使模型產(chǎn)生糖尿病。原因是側(cè)腦室注射，使藥物不能通過血腦屏障，不能對(duì)胰腺產(chǎn)生毒性作用，卻可以對(duì)腦內(nèi)胰島素受體產(chǎn)生破壞作用，影響腦的能量代謝，引起神經(jīng)元的破壞，從而引起癡呆。并未引起外周血糖的任何變化，說明其致癡呆性與血糖無關(guān)，但可引起大腦持久的葡萄糖和能量代謝障礙，不但使海馬膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶水平降低，還引起動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。這個(gè)模型與人患AD的病理及臨床特征相似，既出現(xiàn)認(rèn)知功能的進(jìn)行性惡化，也有腦葡萄糖和能量代謝功能的障礙［8］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射STZ術(shù)后10 d，對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，模型組與多奈哌齊治療組的潛伏期與對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)，過平臺(tái)次數(shù)明顯下降，表明STZ側(cè)腦室注射10 d后，大鼠的認(rèn)知功能明顯下降。側(cè)腦室注射STZ制造大鼠癡呆模型可靠性好，穩(wěn)定性高，與先前文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致［3，9］。

術(shù)后給予多奈哌齊治療8周，對(duì)大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，與模型組比較，多奈哌齊治療組的潛伏期明顯縮短，過平臺(tái)次數(shù)明顯增加，表明多奈哌齊治療改善大鼠認(rèn)知功能。

電鏡下觀察大鼠海馬細(xì)胞結(jié)構(gòu)，模型組海馬細(xì)胞皺縮，表面微絨毛消失，線粒體嵴斷裂或空泡變，核周板層體崩解形成髓樣變，其他細(xì)胞器消失。多奈哌齊治療組表面微絨毛豐富，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和膜結(jié)構(gòu)完好，胞質(zhì)、核周板層體豐富，結(jié)構(gòu)完整。表明多奈哌齊通過減輕AD模型鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，從而起到改善臨床癥狀的作用。

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（收稿日期：2013?05?14）

Effects of donepezil on ratsw ith A lzheimer's disease induced by intracerebroventricular injection of streptozotocin

SHEN Dong?fang，ZHANG Li?wei，SONG Rong?rong.Department ofNeurology，the Fourth Affiliated Hospital ofHaerbin Medical University，Haerbin 150001，China

Objective To investigate the effects of donepezil on rats with Alzheimer's disease（AD）induced by in?tracerebroventricular injection of streptozotocin. M ethods Twenty?four healthy SD rats were random ly divided into con?trol group，model group and donepezil treatment group（n＝8）.Donepezil treatment group received treatment of donepezil gavage（0.45 mg/kg·d））for10 days before surgery，and the treatmentwas continued for 8 weeks postoperatively.Mean?while，control group and model group received the same volume of saline.During the surgery，the streptozotocin dissolved in 0.9％Na citrate buffer was injected into both of the lateral cerebral ventricles（3 mg/kg）on the first and third day re?spectively in themodel group and treatmentgroup，and the same volume of citric acid bufferwas injected into cerebral ven?tricles in the control group.Each group was tested by Morrismaze to exam the abilities of learning and memory ability on the 10th day and 8 weeks after the operation，respectively.The neurological apoptotic status of hippocampus were studied by electron microscope 8 weeks after the operation. Results The latency of Morris maze was prolonged significantly（P＜0.01）and the time of passing through the platform was decreased significantly（P＜0.01）on the 10th day after the operation in both model and treatment group compared with control group.Eightweeks after the operation，the latency was decreased significantly（P＜0.01），the times increased significantly（P＜0.01），and the neurological apoptotic status of hippocampuswere less severe in treatment group compared withmodel group. Conclusions The ratmodel with AD in?duced by intracerebroventricular injection of Streptozotocin is stable.Donepezil could improve the learning and memory ability of ratswith AD，through alleviating the neurological apoptosis of hippocampus.

Alzheimer's disease；streptozotocin；donepezil；neurological apoptosis

R 749.16

A

10.3969/j.issn.1003?9198.2013.12.010

2013?07?25）

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（0200869）

150001 黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

宋榮蓉，Email：songrongrong12＠163.com