劉國榮，張郡瑩，王成濤，李平蘭*，任 麗

(1.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點實驗室，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件

劉國榮1，張郡瑩1，王成濤1，李平蘭2,*，任 麗1

(1.北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京重點實驗室，北京 100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

以分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道的產(chǎn)細菌素動物雙歧桿菌(Bif i dobacterium animal)B04為研究對象，以單核細胞增生李斯特菌為細菌素抑菌活性測試指示菌，以相對抑菌效價為考察指標(biāo)，對雙歧桿菌菌株B04所產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。首先考察不同接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及起始pH值4個因素對細菌素合成的影響，確定培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及起始pH值3個因素對細菌素的相對抑菌效價影響較為顯著，故再選取這3個因素進行響應(yīng)面試驗優(yōu)化。獲得優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件確定為：接種量1%、起始pH 6.3、培養(yǎng)溫度36℃、培養(yǎng)時間29h。在此優(yōu)化條件下，細菌素相對抑菌效價高達3479.25AU/mL，比優(yōu)化前(1032.66AU/mL)提高了2.37倍。同時，最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的實驗結(jié)果與模型預(yù)測值相吻合，說明所建立的回歸模型是切實可行的。

響應(yīng)面；細菌素；動物雙歧桿菌；發(fā)酵條件

乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體機制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點，已成為天然食品生物防腐劑研究與開發(fā)的熱點[1-2]。然而，由于受到培養(yǎng)條件、細菌生長期及自身誘導(dǎo)肽的調(diào)控，乳酸菌代謝產(chǎn)細菌素的水平往往很低，嚴重制約了細菌素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用[2-5]。

雙歧桿菌(Bifodobacterium spp.)是寄生在人和動物腸道內(nèi)的典型有益乳酸菌，它可以對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。已報道[6-9]有少數(shù)雙歧桿菌屬菌株也可產(chǎn)生細菌素，如兩歧雙歧桿菌(B. bif i dum)、動物雙歧桿菌(B. animals)、嬰兒雙歧桿菌(B. infants)、嗜熱雙歧桿菌(B. thermophilum)等。

動物雙歧桿菌(B. animal)B04分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道，是國內(nèi)首次報道的產(chǎn)細菌素雙歧桿菌菌株[7]。前期對該菌株所產(chǎn)細菌素的抑菌特性進行研究，發(fā)現(xiàn)其有非常良好的食品加工特性，同時抑菌譜較廣，有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力。本研究以該菌株為研究對象，通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件，獲得該菌代謝產(chǎn)生細菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為該菌株在工業(yè)上大量生產(chǎn)細菌素提供一定的實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

產(chǎn)細菌素動物雙歧桿菌B04分離自中國廣西巴馬長壽老人腸道，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室提供。指示菌單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)ATCC 35152由加拿大食品安全研究所Mansel Griffiths教授提供。

雙歧桿菌培養(yǎng)基(TPY培養(yǎng)基)、指示菌培養(yǎng)基(TSYEA固體培養(yǎng)基、TSYEB液體培養(yǎng)基) 北京陸橋技術(shù)有限公司。

乳酸鏈球菌素Nisin(1×106IU/g) 美國Sigma公司；HCl、NaOH均為分析純。

1.2 發(fā)酵上清液的制備

按1%的接種量將菌株B04接種于新鮮的TPY培養(yǎng)基中，37℃條件下靜置厭氧培養(yǎng)。24h后結(jié)束培養(yǎng)，8000r/min離心10min去除菌體細胞，調(diào)上清液pH值至7.0左右后，對其進行抑菌活性檢測。

1.3 抑菌活性的測定

采用牛津杯雙層瓊脂平板擴散法測定中和后發(fā)酵上清液的抑菌活性[10]。采用標(biāo)準曲線法測定細菌素的相對抑菌效價[11-12]，具體為：以單核細胞增生李斯特菌ATCC 35152為指示菌，以乳酸鏈球菌素Nisin為陽性對照，首先制作細菌素相對抑菌效價標(biāo)準曲線，然后將待測發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑代入效價回歸方程：y=0.2009x+2.8876(R2=0.9939)，其中y表示相對抑菌效價的對數(shù)值；x表示抑菌圈直徑/mm。計算發(fā)酵液中細菌素的相對抑菌效價。

1.4 單因素試驗

選擇接種量、發(fā)酵起始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間作為影響抑菌活性的主要因素，通過單因素試驗選取響應(yīng)面試驗的因素和水平。

1.4.1 接種量的影響

分別以0.5%、1%、3%、5%、10%的接種量接種動物雙歧桿菌B04，發(fā)酵起始pH 值為7.0、培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.4.2 發(fā)酵起始pH值的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04，發(fā)酵起始pH 值分別設(shè)為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0，培養(yǎng)溫度37℃、培養(yǎng)時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.4.3 培養(yǎng)溫度的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04，發(fā)酵起始pH 6.5，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為25、30、37、40、45℃，培養(yǎng)時間24h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.4.4 培養(yǎng)時間的影響

以1%接種量接種動物雙歧桿菌B04、發(fā)酵起始pH 6.5、培養(yǎng)溫度30℃，分別在不同培養(yǎng)時間(0、3、6、9、12、15、18、21、24、30、36、48、60、100h)取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性和活菌數(shù)。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵起始pH值(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、培養(yǎng)時間(X3)3個因素為自變量，以相對抑菌效價為響應(yīng)值，進行中心組合試驗設(shè)計。每個試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。將實驗后的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，并對回歸方程進行方差分析及擬合度檢驗，討論模型所在響應(yīng)面特征，預(yù)測響應(yīng)值是否為極大值、極小值，或是鞍點。若為極值，則進行驗證；若為鞍點，則進行脊嶺分析，確定在何處進行實驗可得到最好結(jié)果。

表1 試驗因素水平及編碼Table1 Factors and levels of central composite design

1.6 模型的驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化動物雙歧桿菌代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件，并以優(yōu)化后的條件參數(shù)進行發(fā)酵實驗，比較模型預(yù)測值和實驗值，驗證模型的有效性。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗重復(fù)3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.05軟件進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌B04產(chǎn)細菌素單因素試驗結(jié)果

2.1.1 接種量的影響

圖1 不同接種量對動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.1 Effect of inoculum amount on bacteriocin production from B. animals B04

由圖1 可知，接種量為1%時該細菌素的抑菌活性較高，但是方差分析結(jié)果顯示不同接種量對該細菌素的合成影響并不顯著(P＞0.05)，這可能是由于細菌素是細菌生長到一定階段，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的，它的合成是受菌體細胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的[5]。雖然試驗最開始采用了不同的接種量，但是在發(fā)酵24h后，各處理菌體數(shù)量基本一致，所以細菌素的代謝合成量也差異不大。鑒于此結(jié)果，在后期的響應(yīng)面優(yōu)化試驗中未選擇接種量作為考察因素。

2.1.2 起始pH值的影響

圖2 不同起始pH值對動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.2 Effect of initial pH on bacteriocin production from B. animals B04

由圖2 可知，發(fā)酵起始pH值對該菌株產(chǎn)細菌素的影響較為顯著(P＜0.05)，當(dāng)發(fā)酵起始pH值在4.5～6.5范圍內(nèi)時，菌株B04代謝產(chǎn)細菌素的抑菌活性迅速增加，當(dāng)發(fā)酵pH值為6.5時抑菌圈直徑達到最大。之后，隨發(fā)酵pH值的繼續(xù)升高，抑菌活性呈逐漸下降趨勢。這可能是由于某些酸性或堿性條件使得細菌素的轉(zhuǎn)錄翻譯過程受阻，也可能與不同pH值條件下，菌體細胞對細菌素的吸附能力不同有關(guān)。根據(jù)相對抑菌效價的測定結(jié)果，確定該菌株產(chǎn)生細菌素的最適起始pH值為6.5，并選擇起始pH 6.5作為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

2.1.3 培養(yǎng)時間的影響

由圖3可知，菌株B04在對數(shù)生長期(9h)開始產(chǎn)生細菌素，進入穩(wěn)定期后細菌素產(chǎn)量持續(xù)增加，30h時細菌素的效價值達到最大值。此后，細菌素的產(chǎn)量不斷地下降。通常認為細菌素的產(chǎn)生與生長相關(guān)聯(lián)，有些細菌素在細胞開始生長時即可產(chǎn)生，而有些細菌素則在對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期才會產(chǎn)生。該細菌素在生長到一定時間(48h)后抑菌活性明顯降低，這可能是由于菌體生長進入衰亡期，生長環(huán)境改變，使菌體發(fā)生自溶，釋放的蛋白酶降解了部分細菌素，使其效價降低。也可能是由于發(fā)酵后期產(chǎn)酸積累較多，使得細菌素被吸附到產(chǎn)生菌細胞表面，引起發(fā)酵液中細菌素效價降低[13-14]。相對抑菌效價的測定結(jié)果顯示，菌株B04產(chǎn)細菌素的最適培養(yǎng)時間為30h。本實驗中，不同培養(yǎng)時間下，菌株B04所產(chǎn)細菌素的抑菌活性存在有顯著差異(P＜0.05)，因而，選擇培養(yǎng)時間30h作為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

圖3 動物雙歧桿菌B04的生長及抑菌活性曲線Fig.3 Growth and bacterial inhibitory curves of B. animals B04

2.1.4 培養(yǎng)溫度的影響

圖4 不同培養(yǎng)溫度對動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production from B. animals B04

由圖4可知，不同的培養(yǎng)溫度對細菌素的產(chǎn)量有較大影響(P＜0.05)。當(dāng)菌株B04的培養(yǎng)溫度為25℃時，細菌素產(chǎn)量很少，抑菌活性僅為250.72AU/mL。隨著溫度的升高，細菌素的抑菌活性不斷增強，當(dāng)溫度為37℃時，抑菌活性達到最高(2704.2AU/mL)，然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，細菌素產(chǎn)量明顯下降。因此，確定菌株B04合成細菌素的最適溫度為37℃，并選擇其作為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

現(xiàn)已報道的各種細菌素產(chǎn)生的最適培養(yǎng)溫度差異較大，如戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)31-1產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)溫度為30℃[15]，擴展短桿菌(Brevibacterium linens) ATCC 9175在28℃時細菌素的產(chǎn)量最高[16]，屎腸球菌(Enterococcus faecium)RZS C5產(chǎn)細菌素的溫度則必須控制在35℃[17]等。從這些研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，菌株產(chǎn)細菌素的最適溫度同菌株生長最適溫度存在偏差，這也充分說明雖然細菌素的產(chǎn)生與菌株的生長狀況是密切相關(guān)的[13,18]，但是菌體生長的最適溫度不一定適合細菌素的生成。已有少數(shù)學(xué)者研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，細菌素在低于菌體最適生長溫度的條件下產(chǎn)量較高，并推測細菌素的產(chǎn)生是一種對不適于其生長環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)，稍低于最適生長溫度的生長條件能夠刺激菌體細胞產(chǎn)生細菌素。

2.2 雙歧桿菌B04產(chǎn)細菌素響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

采用中心組合試驗設(shè)計，方案及結(jié)果見表2。用Design Expert 8.05軟件對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到雙歧桿菌B04所產(chǎn)細菌素相對抑菌效價(Y)對起始pH值(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、培養(yǎng)時間(X3)的多項回歸方程為：

Y=3412.20—233.25X1—654.00X2—198.75X3+420.25 XX+17.25XX+58.75XX—951.98X2—1526.47X2—12132312612.97 X23

表2 中心組合試驗方案及結(jié)果Table2 Design and results of central composite tests

2.2.2 回歸模型方差分析

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3?？梢钥闯觯貧w模型的P = 0.0009，失擬項的P = 0.3770，模型回歸極顯著，失擬檢驗不顯著，說明未知因素對實驗結(jié)果干擾很小，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當(dāng)。同時，該模型的決定系數(shù)為0.9735，說明該方程與實際情況擬合很好，較好地反映了細菌素抑菌活性與培養(yǎng)基起始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間的關(guān)系，因此可用該模型對雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)條件進行分析和預(yù)測?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型一次項X2極顯著，X1、X3不顯著；二次項X12、X22均處于極顯著水平，X32處于顯著水平；交互項X1X3、X1X2、X2X3均不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 響應(yīng)曲面圖及其等高線

圖5 起始pH值和培養(yǎng)溫度對菌株B04代謝產(chǎn)細菌素影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between innitial pH and fermentation temperature on bacteriocin production

圖6 起始pH值和培養(yǎng)時間對菌株B04代謝產(chǎn)細菌素影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of cross-interaction between innitial pH and fermentation time on bacteriocin production

圖7 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對菌株B04代謝產(chǎn)細菌素影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between fermentation temperature and fermentation time on bacteriocin production

由回歸方程所作的響應(yīng)面立體分析圖及其等高線如圖5～7所示，它們分別反映了起始 pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間這3個因素的兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。通過方程可知，二次項的系數(shù)均為負值，其所表征的拋物面開口向下，具有極大值點。利用Design Expert 軟件，進行分析計算，可得合成細菌素的最佳培養(yǎng)條件為：初始pH6.33、培養(yǎng)溫度36.17℃、培養(yǎng)時間29.4h，在此條件下細菌素的相對抑菌效價預(yù)測值為3503.49AU/mL。結(jié)合實際操作的方便和方差分析結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)條件為：起始pH6.3、培養(yǎng)溫度36℃、培養(yǎng)時間29h。

2.2.4 回歸模型的驗證

為了進一步驗證預(yù)測值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進行3 次重復(fù)搖瓶實驗，細菌素相對抑菌效價的平均值為3479.25AU/mL，與預(yù)測值擬合率達99.31%，表明預(yù)測值和實際值有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。同時，優(yōu)化后的細菌素相對抑菌效價(3479.25AU/mL)比優(yōu)化前(1032.66AU/mL)提高了2.37倍，說明本實驗所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高細菌素的產(chǎn)量。

3 結(jié) 論

3.1 單因素優(yōu)化試驗結(jié)果顯示：動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的最佳接種量1%、最佳起始pH6.5、最佳培養(yǎng)時間30h、最佳培養(yǎng)溫度37℃。

3.2 在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，建立了細菌素相對抑菌效價與培養(yǎng)基起始pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3個因素的二次多項式回歸模型，經(jīng)驗證實驗證明該模型合理可靠。

3.3 確定動物雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)條件為：起始pH6.3、培養(yǎng)溫度36℃、培養(yǎng)時間29h、接種量為1%。在此條件下，細菌素相對抑菌效價高達3479.25AU/mL，較優(yōu)化前提高了2.37倍。

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Optimization of Fermentation Conditions for Bacteriocin Production from Bif i dobacterium animal B04 by Response Surface Methodology

LIU Guo-rong1，ZHANG Jun-ying1，WANG Cheng-tao1，LI Ping-lan2,*，REN Li1
(1. Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The fermentation conditions for bacteriocin production from Bifidobacterium animal B04 isolated from centenarians’ intestine were optimized. The bacteriocin inhibitory activity (AU/mL) was used as evaluation index and quantified against L. monocytogenes ATCC 35152. Firstly, the effects of single factors including inoculum amount, initial pH, fermentation temperature and fermentation time on bacteriocin production from strain B04 were explored. Based on these single factor tests, response surface methodology with three variables such as initial pH, fermentation temperature and fermentation time was employed to optimize the fermentation conditions for bacteriocin production. Results showed the optimal fermentation conditions were inoculum amount of 1%, initial pH of 6.3, fermentation time of 29 h and fermentation temperature of 36 ℃. Under these optimal conditions, the bacteriocin inhibitory activity was increased by 2.37 fold and reached up to 3479.25 AU/mL. Finally, the consistent results between the predicted value and actual value indicated the established model in this study is feasible.

response surface methodology；bacteriocin；Bif i dobacterium animal；fermentation condition

TQ920.6

A

1002-6630(2013)03-0147-06

2012-09-14

國家自然科學(xué)基金項目(31201407)；北京市自然科學(xué)基金項目(5133034)；學(xué)科與研究生教育-食品學(xué)科特色教學(xué)科研創(chuàng)新平臺建設(shè)項目(PXM2012-014213-000063)

劉國榮(1983—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物學(xué)。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：李平蘭(1964—)，女，教授，博士，研究方向為乳酸菌及其活性代謝產(chǎn)物的理論與應(yīng)用。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn