植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用

王今雨，滿朝新，楊相宜，董鑫悅，郎 友，閆天文，姜毓君,*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學 國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用

王今雨1,2，滿朝新1，楊相宜2，董鑫悅2，郎 友2，閆天文2，姜毓君1,2,*

(1. 東北農(nóng)業(yè)大學 國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

植物乳桿菌NDC 75017分離自中國內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品。本實驗對其體外環(huán)境耐受性及其降膽固醇作用進行研究。采用活菌計數(shù)法檢測植物乳桿菌NDC 75017在pH 2.0～3.0的酸性環(huán)境、膽鹽質(zhì)量濃度0.3g/100mL、NaCl質(zhì)量濃度0～7g/100mL以及模擬人工消化液環(huán)境下的耐受情況；同時以鄰苯二甲醛法測定其體外降膽固醇能力。結(jié)果表明：植物乳桿菌NDC 75017可耐受pH3.0及0.3g/100mL膽鹽環(huán)境；在7g/100mL的高鹽質(zhì)量濃度條件活菌數(shù)仍可達108CFU/mL；可以通過胃進入腸道而保持活性，在腸道處理8h后存活率為58.73%。體外降膽固醇實驗測得細菌發(fā)酵上清液、菌體洗滌液和細胞破碎液中的膽固醇脫除率分別為16.43%、26.35%和32.87%。植物乳桿菌NDC 75017環(huán)境耐受能力良好，具有體外降膽固醇作用，該菌株可以作為降膽固醇的潛在益生菌。

植物乳桿菌；降膽固醇；消化道耐受性

高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病是當前導致人類死亡的主要原因，研究發(fā)現(xiàn)，血脂中總膽固醇的減少能降低高血脂人群患心血管疾病的風險[1]。益生菌是一類能夠?qū)θ梭w健康起到促進作用的活體微生物。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性，降低血清膽固醇水平是其重要的生理活性之一[2]。已有研究證明，適量飲用含有乳酸菌的發(fā)酵乳可使血液膽固醇含量降低，其中，乳酸桿菌是一類對人體有重要益生功能的細菌, 作為胃腸道生態(tài)系統(tǒng)固有菌種，其益生功能被廣泛研究[3-6]。

本實驗以分離自中國內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017為研究對象，對其體外耐受能力及其體外降膽固醇作用進行研究，以期為開發(fā)具有降膽固醇特性的發(fā)酵乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌NDC 75017分離自內(nèi)蒙古通遼地區(qū)的牧民自制發(fā)酵酸奶。

膽鹽、膽固醇(分析純) 美國Sigma公司；鄰苯二甲醛、巰基乙酸鈉、冰醋酸、正己烷(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、牛肉膏0.5g、酵母粉0.5g、胰蛋白胨1.0g、吐溫-80 0.1mL、葡萄糖2.0g、磷酸氫二鉀0.2g、檸檬酸氫二銨0.2g、乙酸鈉0.5g、硫酸鎂0.05g、硫酸錳0.025g，蒸餾水定容至100mL，調(diào)pH值至5.8。

MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入0.20%的巰基乙酸鈉、0.3g/100mL膽鹽和100μg/mL膽固醇，加熱溶解，121℃滅菌 15min 后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN1360型生物潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器公司；DU800紫外分光光度計 美國Beckman公司；TGL-16G離心機 上海安亭科技儀器廠；滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；超聲波破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 環(huán)境耐受性實驗

1.3.1.1 耐酸性實驗

菌株以2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，37℃活化培養(yǎng)兩代，生理鹽水洗滌3次，離心收集菌體，制備菌懸液。將菌懸液按2%重懸于pH 3.0和pH 2.0的液體MRS培養(yǎng)基(4.0mol/L HCl調(diào)整)，置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、1、2、3h后取樣。取菌液用滅菌生理鹽水進行10倍稀釋，取適量稀釋液涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，采用平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)[7]，每個梯度設(shè)3個平行，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體做對照，計算存活率。

式中：Nt為低pH值MRS培養(yǎng)不同時間后的活菌數(shù)；No為pH5.8 MRS中培養(yǎng)不同時間后的活菌數(shù)。

1.3.1.2 耐膽鹽實驗

菌株37℃活化培養(yǎng)兩代后，以生理鹽水洗滌3次，離心(5000r/min，10min)收集菌體，制備菌懸液。將菌懸液以2%接種量接至含0.3g/100mL膽酸鹽的MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12h。取菌液用滅菌生理鹽水進行10倍稀釋，取適當稀釋液涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，進行菌落計數(shù)，每個梯度設(shè)3個平行，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體做對照，計算存活率。

式中：Nt為 含0.30g/100mL牛膽酸鈉的 MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)；No為MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)。

1.3.1.3 耐鹽實驗

菌株以2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，37℃活化培養(yǎng)兩代，生理鹽水洗滌3次，離心收集菌體，制備菌懸液。將菌懸液按2%分別接種至NaCl質(zhì)量濃度為0～7g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h后取樣。取菌液用滅菌生理鹽水進行10倍稀釋，取適當稀釋液涂布MRS瓊脂培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24h，進行菌落計數(shù)，每個梯度設(shè)3個平行，以MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌體做對照，計算存活率。

式中：Nt為不同NaCl質(zhì)量濃度的MRS培養(yǎng)基中活菌數(shù)；No為MRS培養(yǎng)基中的活菌數(shù)。

1.3.1.4 人工胃液和人工腸液耐受性實驗

菌株以2%的接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基，37℃活化培養(yǎng)兩代，生理鹽水洗滌3次，離心收集菌體，制成菌懸液備用。將制備好的菌懸液按2%接種量接種至過濾除菌的pH3.0的人工胃液中37℃培養(yǎng)0、1、2、3h后取樣，測定其活菌數(shù)。然后，分別無菌吸取處理0、1、2、3h后的含菌人工胃液[8]，以2%接種量接種至過濾除菌的pH8.0的人工腸液中[9]，繼續(xù)置37℃培養(yǎng)，分別在0、3、5、7、8h后測定活菌數(shù)。

人工胃液：NaCl 0.2%、胃蛋白酶 0.35%，用1mol/L HCl調(diào)整pH值為3.0后，0.22μm濾膜過濾除菌備用。

人工腸液：將下述a液和b液以2:1混合即為人工腸液。a胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶0.1%，調(diào)整pH值為8.0后，過濾除菌備用。b膽液：膽鹽1.2%，調(diào)整pH值為8.0后，過濾除菌備用。

式中：Nt為菌體在人工消化液培養(yǎng)不同時間后的活菌數(shù)；No為菌體在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間后的活菌數(shù)。

1.3.2 體外降膽固醇能力的測定

1.3.2.1 繪制膽固醇標準曲線

取質(zhì)量濃度為10～60μg/mL的膽固醇溶液1mL，加入2mL質(zhì)量濃度為0.5mg/mL的鄰苯二甲醛溶液及1mL濃硫酸，振蕩混勻后，室溫條件下顯色10min，在波長550nm處測吸光度。以膽固醇的質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，進行函數(shù)擬合得到曲線回歸方程，用于計算膽固醇的質(zhì)量濃度。

1.3.2.2 膽固醇質(zhì)量濃度的測定

植物乳桿菌NDC 75017菌液(2%的接種量)接入MRSCHOL-THIO培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后5000r/min離心10min，取上清液0.5mL于干凈試管中，依次加入3mL體積分數(shù)為95%的乙醇和 2mL質(zhì)量分數(shù)為33%的氫氧化鉀溶液，漩渦振蕩混勻后置于60℃水浴中皂化10min，迅速冷卻后加入5mL正己烷，漩渦振蕩進行萃取，加入3mL水，重復振蕩混勻后在室溫靜置15min使各相分層。準確吸取正己烷層2.5mL于潔凈試管中，置于 60℃水浴中用氮氣吹干溶劑，加入4mL鄰苯二甲醛顯色劑，漩渦振蕩后靜置10min，加入2mL濃硫酸立即混勻，室溫靜置 10min 后，在90min內(nèi)于波長550nm 處測吸光度。根據(jù)膽固醇與吸光度標準曲線回歸方程計算膽固醇的質(zhì)量濃度，同時測定菌體洗滌液和菌體破碎液中膽固醇的含量，計算膽固醇的脫除率。

菌體洗滌液：傾出上清液，加入5.0mL質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水懸浮，12000r/min離心10min，取上清液即為菌體洗滌液。

細胞破碎液：傾出菌體洗滌液，再加入5.0mL質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水懸浮，置于冰浴中并在超聲波破碎儀中破碎(80%輸出，10s/次，間隔5s)30min，破碎后4℃，5000r/min離心10min，上清液即為菌體破碎液。

式中：ρ1為菌種接至MRS-CHOL-THIO培養(yǎng)后培養(yǎng)上清液(或菌體洗滌液、細胞破碎液)中膽固醇的質(zhì)量濃度；ρ0為初始培養(yǎng)基總膽固醇的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境耐受性實驗結(jié)果

2.1.1 耐酸性實驗結(jié)果

圖1 植物乳桿菌NDC 75017對酸的耐受性Fig.1 Tolerance of L. plantarum NDC75017 to acid

通?；罹ㄖ材c道的前提條件是其能夠耐受胃中的pH值酸環(huán)境，胃液pH值因飲食結(jié)構(gòu)不同而有較大波動，如空腹時胃液的pH值為0.9～1.8，進食過程中pH值在1.8～5.0，通常維持在3.0左右[10]。食物在胃中的消化時間相對較短，一般為1～3h。因此實驗選擇2個不同pH值(2.0、3.0)，培養(yǎng)時間為1、2、3h。

由圖1可知，植物乳桿菌NDC 75017不能耐受pH2.0；在pH3.0條件下處理1～3h，存活率分別為53.66%、28.46%和10.57%，對pH3.0具有較強的耐受能力，可見，該菌株具備一定的耐受胃中酸性環(huán)境的能力。

2.1.2 耐膽鹽實驗結(jié)果

菌株本身的特性以及膽鹽質(zhì)量濃度可決定菌株對膽鹽的耐受能力。人體小腸存在一定質(zhì)量濃度的膽鹽，維持在0.3g/100mL。本實驗選用0.3g/100mL膽酸鹽質(zhì)量濃度下來考察菌株的膽鹽耐受情況。結(jié)果表明，在此條件下，存活率能達到84.31%，這表明，該菌株對膽鹽表現(xiàn)出較強的耐受性。

2.1.3 耐鹽實驗結(jié)果

人體細胞的外環(huán)境為人的體液，隨著飲食變化，體液中的Na+和Cl—等濃度會隨之升高，從而改變?nèi)梭w滲透壓[11]。微生物對滲透壓有一定的適應能力，若滲透壓改變較大，則對微生物的生長不利，甚至死亡。人體胃腸道中NaCl質(zhì)量濃度在1～4g/100mL的范圍波動。本實驗將植物乳桿菌NDC 75017按2%接種量分別接入NaCl質(zhì)量濃度為0～7g/100mL的MRS液體培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)24h后采用MRS固體培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)。

圖2 植物乳桿菌NDC 75017對NaCl的耐受性Fig.2 Tolerance of L. plantarum NDC75017 to sodium chloride

由圖2可知，培養(yǎng)24h后，植物乳桿菌NDC 75017活菌數(shù)隨NaCl的質(zhì)量濃度增加而降低，但在7g/100mL的高鹽濃度下，菌數(shù)仍然可以達到108CFU/mL以上。卜永士等[12]研究表明，干酪乳桿菌(L.casae)BDⅡ能夠耐受6.5%的NaCl；徐義剛等[9]研究表明，重組干酪乳桿菌在鹽7.0%的條件下仍可以生長。由此說明，植物乳桿菌NDC 75017耐高滲環(huán)境能力較強，可在人體內(nèi)良好的生存。

2.1.4 人工胃液和人工腸液耐受性實驗結(jié)果

2.1.4.1 人工胃液耐受性實驗結(jié)果

益生菌發(fā)揮益生功能的基本條件是以活菌狀態(tài)通過胃腸道。從口腔到腸道過程中，益生菌首先必須以活菌狀態(tài)通過胃才有可能進入腸道。食物在胃中的停留時間一般為1～2h，人體胃液的pH值隨飲食結(jié)構(gòu)的不同而發(fā)生變化，通常維持在pH3.0左右[13]。胃蛋白酶原會在胃液的酸性環(huán)境下被激活，從而殺死隨食物進入胃內(nèi)的細菌。因此，益生菌若在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用，就必須具有一定的耐酸和耐胃蛋白酶的能力。本實驗采用植物乳桿菌NDC 75017在pH3.0條件下，與人工胃液作用不同時間后，檢測到的活菌數(shù)變化。

圖3 植物乳桿菌NDC 75017對人工胃液的耐受性Fig.3 Tolerance of L. plantarum NDC75017 to artificial gastric fluid

由圖3可知，植物乳桿菌NDC 75017在pH3.0的人工胃液中作用1～3h，存活率分別可達到34.23%、26.43%、18.92%，在人工胃液中存活率較高，說明其能耐受胃液酸性及胃蛋白酶環(huán)境，可以通過胃進入腸道并保持活性。

2.1.4.2 人工腸液耐受性實驗結(jié)果

食物經(jīng)過胃液消化后進入腸道，腸道微生物數(shù)量大且種類繁多，腸道菌群的生長受腸液中水分、消化酶、膽汁酸等成分所影響，所以生存在小腸中的益生菌必須具有一定的耐腸液能力并保持一定數(shù)量的活菌數(shù)才能發(fā)揮其益生作用。小腸內(nèi)是pH值大約為7.6的堿性環(huán)境，食物在小腸中的停留時間一般為3～8h。本實驗選取植物乳桿菌NDC 75017經(jīng)過pH8.0的人工腸液作用不同時間后，檢測其菌數(shù)變化以判定其對腸液的耐受能力。

圖4 植物乳桿菌NDC 75017對人工腸液的耐受性Fig.4 Tolerance of L. plantarum NDC75017 to artificial intestinal fluid

由圖4可知，植物乳桿菌NDC 75017經(jīng)人工胃液處理后，在人工腸液中分別作用3、5、7、8h后，存活率分別可達到82.54%、68.25% 、63.49%、58.73%，這表明，在模擬小腸中食物消化吸收的時間內(nèi)，植物乳桿菌NDC 75017可在腸液中保持一定活性，對腸液的耐受性能較好。

2.2 體外降膽固醇實驗結(jié)果

2.2.1 標準曲線

以膽固醇質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度(A550nm)為縱坐標繪制曲線?；貧w方程為y=0.0089x—0.0043(R2=0.9984)，式中：y為吸光度(A550nm)；x為膽固醇的質(zhì)量濃度/(μg/mL)。

2.2.2 不同介質(zhì)中膽固醇的降解情況

乳酸菌降膽固醇的作用機理一直是討論的熱點。有關(guān)乳酸菌降膽固醇機制主要有以下幾種：同化作用[14-15]、共沉淀作用[15]、膽鹽水解酶作用[17-18]。但是隨著進一步的研究，乳酸菌降低膽固醇的現(xiàn)象又有了新的解釋，如Lye等[19]提出了5種降膽固醇作用機理，并認為是同時起作用。本實驗采用鄰苯二甲醛法[20]測定菌體發(fā)酵上清液、菌體洗滌液以及細胞破碎液3種不同介質(zhì)中植物乳桿NDC 75017對膽固醇的降解情況。

圖5 不同介質(zhì)中膽固醇降解情況Fig.5 Cholesterol degradation in different media

由圖5可知，植物乳桿菌NDC 75017在不同介質(zhì)中的膽固醇降解率分別是發(fā)酵上清液為16.43%，菌體洗滌液中為26.35%，細胞破碎液中為32.87%，由此膽固醇降解率可間接說明乳酸菌可以同化膽固醇到自身細胞內(nèi)。

3 結(jié) 論

本實驗首先對植物乳桿菌NDC 75017的耐酸、膽鹽、人工消化液能力進行了研究，在pH3.0條件下處理1～3h，存活率分別為53.66%、28.46%和10.57%；對膽鹽耐受率可達到84.31%；在7g/100mL的高鹽濃度下，菌數(shù)仍然可以達到108CFU/mL以上，對高滲環(huán)境有較強耐受能力；植物乳桿菌NDC 75017可以通過胃進入腸道而保持活性，在腸道處理8h后存活率為58.73%。綜上，植物乳桿菌NDC 75017具有較強的體外環(huán)境耐受能力。

本研究通過體外降膽固醇研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌NDC 75017在體外表現(xiàn)出良好的降膽固醇能力，測定發(fā)酵上清液、菌體洗滌液以及細胞破碎液中的膽固醇降解率分別為16.43%、26.35%和32.87%，由于對其降膽固醇基因等層面的作用機理還不明確，有待進一步研究。由以上結(jié)果可知，植物乳桿菌NDC 75017具有體外降膽固醇能力，為進一步研究植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用機理以及開發(fā)具有降膽固醇特性的發(fā)酵乳提供理論依據(jù)。

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Cholesterol-Lowering Capability of Probiotic Lactobacillus plantarum NDC75017

WANG Jin-yu1,2，MAN Chao-xin1，YANG Xiang-yi2，DONG Xin-yue2，LANG You2，YAN Tian-wen2，JIANG Yu-jun1,2,*
(1. National Research Center of Dairy Engineering and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150086, China；2. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, College of Food Science and Engineering, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Lactobacillus plantarum NDC 75017 was isolated from traditional dairy products in Inner Mongolia of China. The aim of this study is to evaluate the environment-tolerant capability and cholesterol-lowering effect of L. plantarum NDC75017. Viable count was firstly used in this study to detect the tolerance characteristics under simulated gastrointestinal tract environment pH 2.0—3.0. Additionally, bacterial growth was evaluated in the presence of 0.3 g/100 mL bile salt and 0—7 g/100 mL sodium chloride. O-phthalaldehyde was used to detect its cholesterol-lowering capability. The results showed that L. plantarum NDC75017 had tolerance characteristics against pH 3.0 and 0.3 g/100 mL bile salt. The viable bacteria can be up to 108CFU/mL at sodium chloride of7 g/100 mL. L. plantarum NDC75017 kept vitality from stomach to intestines. After8 h incubation in artificial intestinal fluid, the survival rate of the strain remained up to 58.73%. Its cholesterol-lowering rates in bacterial fermentation supernatant, bacteria washing solution and cell disruption solution were 16.43%, 26.35% and 32.87%, respectively. These results indicated that L. plantarum NDC75017 had environment-tolerant characteristics and could be as the probiotics with cholesterol-lowering activity.

Lactobacillus plantarum；cholesterol-lowering effect；tolerance

R151.1

A

1002-6630(2013)03-0243-05

2012-10-10

國家“863”計劃項目(2011AA100902)；國家自然科學基金項目(31171718)；黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(12511z005)；教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”項目(IRT-0959-203)；黑龍江省青年科學基金項目(QC2009C55)

王今雨(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：396359596@qq.com

*通信作者：姜毓君(1971—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術(shù)。E-mail：yujun_jiang@163.com