劉宏生，趙 丹，段艷婷

(遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

禽流感(Avian influenza virus，AIV)是由A型流感病毒引起的、從呼吸系統(tǒng)病變到全身敗血癥的高度接觸性急性傳染病，普遍感染家禽類及鳥類，人類流行病的暴發(fā)也深受其威脅［1］。目前，國(guó)際上根據(jù)AIV致病力的差異，將其分為高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)和低致病性禽流感(low pathogenic avian influenza，LPAI)［2］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2013年10月8日公布的數(shù)據(jù)顯示，自2003年起全球共發(fā)生人感染H5N1禽流感病毒641例，死亡380人，病死率高達(dá)59%［3］。A型流感病毒是負(fù)鏈單股RNA病毒，其基因組包括8個(gè)負(fù)鏈基因組RNA片段，共編碼11個(gè)病毒蛋白［4］。NS1 蛋白(non-structural protein 1，NS1)由A型流感病毒基因組中最小的基因節(jié)段ns基因編碼，在流感病毒的致病性和毒力方面發(fā)揮重要作用。

1 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)

NSl蛋白作為A型流感病毒重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，由流感病毒第8個(gè)節(jié)段的RNA編碼合成，可編碼202～237個(gè)氨基酸(Amino Acid，aa)，相對(duì)分子量約為28 ku。NS1蛋白主要包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N-末端的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RNA-binding domain，RBD)和C-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(effector domain，ED)［5］。NS1 蛋白大部分氨基酸序列保守，但是RNA結(jié)合域和效應(yīng)域之間的連接區(qū)域及羧基末端因毒株不同序列信息有所差異，大多數(shù)H5N1(超過90%)第80～84位氨基酸殘基缺失［6］。NS1蛋白僅存在于病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，感染早期大量存在于細(xì)胞核中，感染晚期也可出現(xiàn)于胞漿中，且能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗NS1蛋白的抗體。蔣培余等［7］制備出H5N1型禽流感病毒NS1蛋白抗體并對(duì)其效價(jià)進(jìn)行了初步測(cè)評(píng)。在2008年12月的《Nature》中，美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院的研究人員利用在2004年越南禽流感爆發(fā)期間分離出的一個(gè)惡性H5N1禽流感病毒毒株，確定了全長(zhǎng)NS1蛋白的結(jié)構(gòu)，顯示NS1全長(zhǎng)蛋白以一種首尾相接的方式形成1條NS1蛋白長(zhǎng)鏈，其中，RNA結(jié)合區(qū)與RNA結(jié)合區(qū)二聚化相連，效應(yīng)區(qū)與效應(yīng)區(qū)二聚化相連。

1.1 RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域

NS1的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域由1～73位氨基酸組成，核心區(qū)位于第19～38位，能夠結(jié)合異源RNA，包括病毒基因組 RNA、病毒 mRNA的5'非翻譯區(qū)、poly(A)RNA 和外源 dsRNA［8］。通過對(duì)NS11～73位氨基酸的核磁共振和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域以對(duì)稱的同源二聚體形式存在，每個(gè)單體包含3個(gè)不同方向的α螺旋:Asn4-Asp24(螺旋1)、Pro31-Leu50(螺旋2)、Ile54-Lys70(螺旋3)，螺旋之間由loop區(qū)連接。NS1蛋白的二聚化對(duì)其結(jié)合dsRNA非常關(guān)鍵，在NS1蛋白和dsRNA結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。Cheng等已測(cè)定了RBD與dsRNA復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)參與dsRNA識(shí)別的關(guān)鍵氨基酸殘基包括Arg38、Arg35、Arg46 、Thr5、Asp29、Asp34、Ser42 和 Thr49等氨基酸，在結(jié)合過程中這幾位氨基酸通過形成氫鍵與RNA雙螺旋產(chǎn)生最初的結(jié)合。這一結(jié)果與通過突變實(shí)驗(yàn)得到的NS1 RBD關(guān)鍵氨基酸結(jié)果一致［9］。另外，研究者還發(fā)現(xiàn)NS1 RBD雖然能與dsRNA相結(jié)合，但其只結(jié)合規(guī)范的A-型dsRNA，而不與 B-型的 dsDNA或 A/B型的 dsRNADNA雜合子結(jié)合［10］。另外，在RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，含有一個(gè)非常保守的核定位信號(hào)(nuclear localization signal 1，NLSl;34～38位aa)，其氨基酸排列順序?yàn)锳sp-Arg-Leu-Arg-Arg，所有的甲型流感病毒均有該保守信號(hào)［11］。

1.2 效應(yīng)結(jié)構(gòu)域

NS1第74位氨基酸至C-末端為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。晶體X-射線衍射確定其結(jié)構(gòu)也是對(duì)稱的同源二聚體，形成一種新的蛋白構(gòu)象—新月折疊。NS1的C-末端效應(yīng)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是NS1與宿主相互作用的主要結(jié)構(gòu)域，其中第134～161位氨基酸為其核心序列，具有阻斷宿主mRNA剪接、多聚腺苷酸化和核輸出等功能［12］。

Bornholdt和Prasad利用X衍射技術(shù)對(duì)NS1蛋白效應(yīng)區(qū)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，指出該區(qū)具有一個(gè)獨(dú)特的折疊結(jié)構(gòu)與H5N1亞型AIV的毒力有關(guān)。Burgui等指出，NS1蛋白具有eIF4GI(eukaryotic translation initiation factor 4GI)結(jié)合區(qū)域，作用部位位于第81～113氨基酸之間，可與eIF4GI結(jié)合，啟動(dòng)病毒蛋白的合成，提高病毒mRNA的翻譯能力。Obenauer等研究發(fā)現(xiàn)，NSl蛋白的C端有PDZ結(jié)構(gòu)的結(jié)合域，是一種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白間相互作用的結(jié)構(gòu)域，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上發(fā)揮重要功能，因此PDZ結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是一種決定流感病毒毒力的重要因子。近來，已有研究證實(shí)磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)調(diào)節(jié)亞基P85β與NS1蛋白存在相互作用，兩者互作能夠?qū)е翽I3K激活，并揭示相互作用的位點(diǎn)是NS1蛋白的效應(yīng)區(qū)以及P85β蛋白的SH2和SH3區(qū)域，指出 NS1的89位Tyr殘基和164位Pro殘基是與P85β蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)［13］。此外，在促進(jìn)NS1蛋白二聚體形成并鞏固其二聚體結(jié)構(gòu)方面，效應(yīng)區(qū)也發(fā)揮著重要的作用。

2 NS1蛋白的功能

NS1蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，分別從病毒和宿主兩個(gè)方面共同調(diào)節(jié)病毒的致病性及毒力。在病毒方面，NS1蛋白通過增強(qiáng)病毒mRNA翻譯從而提高病毒的復(fù)制效率，直接增強(qiáng)AIV抵抗宿主的抗病毒反應(yīng)的能力。在宿主方面，NS1蛋白通過抑制宿主細(xì)胞蛋白的合成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及拮抗干擾素的產(chǎn)生等方式來調(diào)節(jié)機(jī)體的抗病毒反應(yīng)，間接地發(fā)揮增強(qiáng)病毒致病性的功能。

2.1 調(diào)節(jié)流感病毒的致病性及毒力

2.1.1 NS1蛋白對(duì)宿主細(xì)胞蛋白合成具有抑制作用 NS1蛋白可對(duì)宿主細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄后的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)等修飾產(chǎn)生直接影響。如抑制宿主mRNA多聚腺苷酸化，阻斷剪接和細(xì)胞mRNA核轉(zhuǎn)運(yùn)，從而抑制細(xì)胞蛋白表達(dá)［14］。NS1羧基末端的效應(yīng)區(qū)抑制細(xì)胞核mRNA的核輸出的同時(shí)還提高細(xì)胞的前mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的濃度，延長(zhǎng)細(xì)胞核內(nèi)前mRNA的壽命。病毒的帽依賴性內(nèi)切酶能從細(xì)胞前mRNA上將多聚腺苷酸帽子切下作為合成病毒RNA的引物。

2.1.2 NS1蛋白對(duì)宿主細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響 NS1蛋白具有誘導(dǎo)和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用。NS1蛋白主要通過早期抑制細(xì)胞凋亡、晚期促進(jìn)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)對(duì)感染后細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白通過與p53蛋白相互作用，抑制p53蛋白調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的同時(shí)抑制宿主凋亡［15］。流感病毒侵染細(xì)胞后，PI3K/Akt信號(hào)通路可以通過不同方式被激活:病毒NS1蛋白通過與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用激活 PI3K/Akt通路［16］;NS1蛋白也可以直接與 Akt相互作用激活 PI3K/Akt通路［17］。但是，NS1蛋白與PI3K的亞基P85β相互作用是激發(fā)PI3K/Akt信號(hào)通路重要的機(jī)制［18］，并有研究進(jìn)一步確定了NS1與P85β相互作用的區(qū)域是NS1效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與P85β蛋白的SH2和SH3區(qū)域，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NS1蛋白第89位Tyr殘基和第164位Pro殘基是與P85β蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)［13］。

2.1.3 NS1蛋白具有拮抗干擾素及腫瘤壞死因子的作用 研究發(fā)現(xiàn)H5N1 NS1蛋白F103L、M106I兩個(gè)突變，每一突變均能提高病毒毒力增加致死率，提高對(duì)IFN-β的轉(zhuǎn)錄抑制以增強(qiáng)對(duì)干擾素的拮抗作用［19］。NSl蛋白 C端上還存在CPSF30和PABⅡ的結(jié)合位點(diǎn)，NS1效應(yīng)結(jié)構(gòu)域通過與CPSF30、PABⅡ結(jié)合影響細(xì)胞內(nèi)前體RNA 3'-末端加工從而抑制細(xì)胞產(chǎn)生mRNA，并阻止這些前體mRNA的核輸出，抑制宿主細(xì)胞mRNA的加工成熟，最終降低IFN-β的表達(dá)水平［20］。

2.1.4 NS1蛋白有利于病毒的合成 NS1作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，NS1蛋白通過與宿主細(xì)胞因子相互作用，一方面抑制了宿主細(xì)胞核內(nèi)mRNA的剪接和出核，從而抑制了宿主抗病毒因子的表達(dá);另一方面，這種抑制作用也大大提高了前體mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的濃度。由于病毒的帽依賴性內(nèi)切酶能從宿主細(xì)胞前體mRNA上將多聚腺苷酸帽子切下作為合成病毒RNA的引物，所以宿主細(xì)胞前體mRNA在細(xì)胞核內(nèi)的積累有利于病毒mRNA的合成。NS1蛋白的這種功能對(duì)于減少細(xì)胞RNA和病毒RNA在利用細(xì)胞翻譯系統(tǒng)的競(jìng)爭(zhēng)中是有益的［21］。

2.2 NS1蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)的多種蛋白質(zhì)相互作用

作為病毒的致病因子，流感病毒NS1蛋白在細(xì)胞內(nèi)可與多種宿主蛋白相互作用，通過增強(qiáng)病毒蛋白的表達(dá)或者改變宿主蛋白的重新分布等方式，從而增強(qiáng)病毒的致病性和毒力。目前國(guó)際上對(duì)與NS1相互作用的蛋白已有報(bào)道:這些蛋白主要包括人核仁磷酸化蛋白(NOLC1)、Staufen蛋白、真核生物翻譯起始因子4GI(eIF4GI)、NS1結(jié)合因子(NS1-I)、Ploy(A)結(jié)合蛋白 I(PAPB I)、P85β蛋白。劉宏生等［22］實(shí)驗(yàn)證明 NS1蛋白與NOLC1相互作用，并證明相互作用主要是NS1的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域。Falcon A等［23］證實(shí) NS1蛋白與Staufen蛋白具有特異性相互作用，二者的結(jié)合使病毒mRNA定位于恰當(dāng)位置，從而利于病毒蛋白的合成。Tomas等［24］實(shí)驗(yàn)表明 NS1蛋白可與eIF4GI相互作用，使eIF4GI與病毒mRNA 5'-UTR特異性結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)宿主mRNA的翻譯起始，從而利于病毒mRNA的優(yōu)先翻譯。NS1蛋白還可與PAPB I和eIF4GI三者結(jié)合，形成翻譯起始復(fù)合物使病毒mRNA的5'端更有效地游走于核糖體，促進(jìn)病毒mRNA的翻譯。H5N1流感病毒NS1 PDZ結(jié)構(gòu)結(jié)合域的ESEV-ESKV+F138Y能導(dǎo)致小鼠系統(tǒng)感染并提高致死率，單獨(dú)的突變對(duì)毒力影響較小。NS1138位氨基酸不僅影響PI3K/AKT信號(hào)通路，還影響NS1與細(xì)胞PDZ結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用。同樣，PDZ結(jié)構(gòu)結(jié)合域基序的突變?cè)谟绊慛S1與PDZ結(jié)合蛋白的結(jié)合能力外也影響AKt的磷酸化［25］。NS1蛋白還可通過自身的核定位信號(hào)與宿主importinα/β結(jié)合，利用宿主的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制完成自身的運(yùn)輸過程，從而發(fā)揮其功能［26］。NS1蛋白也可與nucleolin蛋白相互作用，干擾nucleolin作用的發(fā)揮，從而抑制宿主細(xì)胞中某些抗病毒蛋白的合成，進(jìn)而增強(qiáng)病毒的復(fù)制［27］。2008年8月，克魯格教授和羅格斯大學(xué)吉他諾·蒙特萊恩教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組更是利用X射線晶體成像技術(shù)獲得了NS1蛋白與人體CPSF30蛋白結(jié)合部位的三維結(jié)構(gòu)圖，使人們能夠在原子水平以獨(dú)特的視角觀察NS1和人體蛋白的結(jié)合，了解NS1蛋白與人體CPSF30蛋白的作用模式以及抑制人體重要的抗病毒反應(yīng)的重要機(jī)制。通過蛋白間的相互作用，NSl蛋白可增強(qiáng)病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯、抑制宿主蛋白的合成、抑制干擾素的產(chǎn)生、下調(diào)細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)病毒粒子的復(fù)制和釋放、改變宿主蛋白的分布、降低宿主抗病毒能力。

3 展望

自21世紀(jì)以來，禽流感暴發(fā)越來越頻繁，范圍也越來越廣，其蔓延速度及暴發(fā)規(guī)模達(dá)到了前所未有的程度，世界各地均受到了嚴(yán)重的影響。目前發(fā)現(xiàn)活禽市場(chǎng)可能是城市病例感染發(fā)病的危險(xiǎn)因素，尚不能排除環(huán)境到人的傳播途徑。各種防控禽流感暴發(fā)的手段正在積極進(jìn)行，但未發(fā)現(xiàn)短期內(nèi)消除高致病性禽流感病毒的有效方法，所以加強(qiáng)對(duì)H5N1禽流感的了解，完善監(jiān)控和預(yù)防禽流感的措施，是目前更好防控禽流感暴發(fā)的重要任務(wù)。目前國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者在致力于高致病性禽流感病毒H5N1的研究，NS1蛋白是一些A型流感病毒研究的熱點(diǎn)。NS1蛋白在細(xì)胞中的作用已被發(fā)現(xiàn)但仍需進(jìn)一步研究其功能，為揭示禽流感病毒致病的機(jī)制及抗禽流感藥物靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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