非O1群、非O139群霍亂弧菌致敗血癥1例報(bào)道

鄒玖明，張愛平，李智山，楊 燕，趙建忠

(1.襄陽市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 襄陽 441021;2.襄陽市中心醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 襄陽 441021)

霍亂弧菌是導(dǎo)致急性霍亂性腹瀉的病原體，其中O1群和O139群霍亂弧菌是導(dǎo)致大流行的主要血清群［1］。非O1群、非O139群霍亂弧菌一般為散發(fā)病例，主要引起輕、中度腹瀉，血流感染較為少見。2012年5月，襄陽市中心醫(yī)院感染性疾病科1例重癥肝炎并發(fā)敗血癥的患者血液中分離出1株疑似霍亂弧菌，對(duì)該菌株進(jìn)行了生化、血清學(xué)分型及16S rRNA種屬鑒定，并就該病例進(jìn)行初步的流行病學(xué)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 患者，男，56歲，重癥肝炎伴肝硬化腹水，因腹脹伴發(fā)熱4 d入院，無腹瀉。入院后即采集血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)果:糞便中未檢出沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌及真菌;血液中分離出疑似霍亂弧菌。之后及時(shí)報(bào)告當(dāng)?shù)丶部夭块T，聯(lián)系患者，詢問病史，患者自述因肝硬化腹水，平時(shí)低鹽飲食，在發(fā)病前一天曾瞞著家人食用自腌咸菜，遂對(duì)剩余咸菜進(jìn)行取樣，亦分離出疑似霍亂弧菌。

1.1.2 菌株 O1群、O139群霍亂弧菌診斷血清(杭州天潤(rùn)生物制品);質(zhì)控菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌 (ATCC27853)本室保存;BacT/Alert 3D 240全自動(dòng)血培養(yǎng)儀(法國(guó)梅里埃)、全自動(dòng)微生物分析儀MicroScan Walk-Away 40(德國(guó)西門子)、堿性蛋白胨水(杭州天和公司)。試驗(yàn)菌株為患者血液及咸菜中分離的2株疑似霍亂弧菌。

1.2 方法

1.2.1 生化鑒定及藥敏試驗(yàn) 將分離到的2株不同來源菌株分別轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，按照MicroScan WalkAway 40全自動(dòng)細(xì)菌分析儀操作程序用接種針取單個(gè)菌落于接種水中，采用NC50復(fù)合板上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 血清鑒定 使用O1群和O139群霍亂弧菌診斷血清分別對(duì)2株不同來源菌株做玻片凝集鑒定，同時(shí)以生理鹽水作陰性對(duì)照。

1.2.3 16S rRNA鑒定 試驗(yàn)菌株接種于堿性蛋白胨水，37℃培養(yǎng)20 h，吸取1 mL菌液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備模板，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6S rRNA的PCR產(chǎn)物利用引物進(jìn)行雙向測(cè)序，所得結(jié)果與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化鑒定及藥敏試驗(yàn)

2株不同來源菌株經(jīng)MicroScan WalkAway 40鑒定儀生化鑒定均為霍亂弧菌，鑒定生物編碼相同(60015155)，符合率99.99%。生化反應(yīng):分解葡萄糖不分解乳糖，動(dòng)力實(shí)驗(yàn)、氧化酶、制動(dòng)實(shí)驗(yàn)均為陽性。符合典型霍亂弧菌生化特性。2株菌藥敏結(jié)果一致，見表1。

表1 非O1群、非O139群霍亂弧菌抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Susceptibility of non-O1 and non-O139 Vibrio cholerae to antimicrobial agents

2.2 血清學(xué)分群

玻片凝集結(jié)果顯示，2株霍亂弧菌對(duì)O1群診斷血清及O139群診斷血清均未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，鑒定為非O1群、非O139群霍亂弧菌。

2.3 16S rRNA種屬鑒定

經(jīng)對(duì)16S rRNA保守基因區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增后產(chǎn)物測(cè)序(見圖1)、序列比對(duì)分析后，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中霍亂弧菌相似性可達(dá)100%。

2.4 治療及預(yù)后

根據(jù)血培養(yǎng)初步報(bào)告選擇氨芐西林治療，患者病情逐漸緩解，體溫恢復(fù)正常。復(fù)查血細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為無細(xì)菌生長(zhǎng)。

圖1 16S rRNA保守基因區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序圖Fig.1 Sequencing picture of 16S rRNA gene PCR products

3 討論

依靠細(xì)菌的生化反應(yīng)特征及免疫學(xué)特性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定是傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法之一，在20世紀(jì)60年代，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展使細(xì)菌分類學(xué)進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。由于16S rRNA基因序列分子大小適中，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，成為理想的研究對(duì)象，可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定，尤其適用于細(xì)菌的同源性分析。本研究中，2株不同來源疑似霍亂弧菌通過生化反應(yīng)及血清學(xué)試驗(yàn)鑒定為非O1群、非O139群霍亂弧菌，16S rRNA分析進(jìn)一步驗(yàn)證了表型結(jié)果。2株菌的生化反應(yīng)特征及藥敏譜均表現(xiàn)一致，在疾病的流行病學(xué)調(diào)查上具有重要意義。此外，2株非O1群、非O139群霍亂弧菌對(duì)已檢測(cè)的幾種抗菌藥物均表現(xiàn)為敏感，但霍亂弧菌可通過多種途徑介導(dǎo)對(duì)細(xì)菌的耐藥性，而且隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，多重耐藥菌株正不斷增多［2］，因此仍應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測(cè)。

非O1群、非O139群霍亂弧菌引起的腸道外感染少見。近年來，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道幾例非O1群、非O139群霍亂弧菌引起的血流感染，2011年P(guān)unpanich W［3］報(bào)道1例珠蛋白生成障礙性貧血行脾臟切除術(shù)后的12歲女孩患者伴發(fā)非O1群、非O139群霍亂弧菌性敗血癥;同年國(guó)內(nèi)鄧馨等［4］報(bào)道1例47歲男性肝硬化患者伴發(fā)非O1群、非O139群霍亂弧菌性敗血癥。O1群、O139群霍亂弧菌主要經(jīng)食物及水源傳播，但由非O1群、非O139群霍亂弧菌導(dǎo)致敗血癥的致病途徑仍不清楚。在本病例中患者并無腹痛、腹瀉，大便黃軟、成形，首發(fā)表現(xiàn)為突起高熱，血液培養(yǎng)檢出霍亂弧菌并經(jīng)分子生物學(xué)方法證實(shí)?；颊咴秤米灾葡滩耍闹幸卜蛛x出霍亂弧菌，2株霍亂弧菌在生化特性、藥敏試驗(yàn)結(jié)果及分子生物學(xué)上均相同，在傳播途徑上分析極可能為食物經(jīng)消化道傳播，其致病機(jī)制仍有待深入探討。但無一例外，脾切除術(shù)后、肝硬化、重癥肝炎患者均有免疫力低下，易伴發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染，本例非O1群、非O139群霍亂弧菌引起的血流感染原因也有可能與此有關(guān)。

［1］Safa A，Nair GB，Kong RY，et al.Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1［J］.Trends Microbiol，2010，18(1):46-54.

［2］葉曉敏，盧春.霍亂弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)影響生物膜形成的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2010，30(1):80-83.

［3］Punpanich W，Sirikutt P，Waranawat N.Invasive Vibrio cholerae non-O1 non-O139 infection in a thalassemic child［J］.J Med Assoc Thai，2011，94 Suppl 3:S226-30.

［4］鄧馨，銀林，喻華.肝硬化患者血液中檢出非O1群霍亂弧菌鑒定檢測(cè)報(bào)告［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(2):202.