孔漢金，張克山，劉永杰，尚佑軍，吳 斌，劉湘濤＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州730046；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，湖北武漢430070）

差異蛋白質(zhì)組學被認為是了解細胞功能和疾病發(fā)生過程的關(guān)鍵。比較不同生理或病理條件下蛋白質(zhì)組差異表達，鑒定和分析差異蛋白對細胞代謝的影響有助于揭示細胞的生理機能及疾病致病機理。依據(jù)各個細胞成份在空間結(jié)構(gòu)、功能和分布的不同，可將其劃分為不同的細胞區(qū)域或功能相關(guān)的蛋白復(fù)合體。目前，大多數(shù)蛋白組研究者以亞細胞蛋白質(zhì)組作為切入點，即先通過研究亞細胞蛋白質(zhì)組學，進而將各亞細胞結(jié)構(gòu)蛋白組進行整合分析，從而獲得對全細胞蛋白質(zhì)組的整體認識。亞細胞蛋白質(zhì)組主要對亞細胞區(qū)室、細胞器、大分子結(jié)構(gòu)和多蛋白復(fù)合物所包含的蛋白質(zhì)進行研究分析，明確不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表達情況對亞細胞功能聯(lián)系的重大意義。本文就近年來亞細胞蛋白質(zhì)組研究概況做一綜述，并對研究結(jié)果所揭示的生物學意義進行了討論分析。

1 亞細胞蛋白組的分離及純化

亞細胞結(jié)構(gòu)的提取和純化是亞細胞蛋白質(zhì)組研究的基礎(chǔ)。蛋白常規(guī)差速離心結(jié)合密度梯度沉降分離方法應(yīng)用較為廣泛，其原理是根據(jù)不同亞細胞組分的密度和沉降系數(shù)來分離亞細胞組分。分離的先后順序依次為細胞核，線粒體，溶酶體與過氧化物酶體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體，最后為核糖體。細胞核與線粒體密度差異顯著，利用離心方法分離效果明顯，但其他細胞器間大小、密度相互重疊，密度梯度沉降時不同組分相互混合，難以達到完全分離的目的。相繼出現(xiàn)的分步抽提法，電泳分離法（高效密度梯度電泳和免疫自由流電泳）、免疫親和法、流式細胞法、雙向系統(tǒng)法和親和純化－免疫磁珠純化分離等方法極大地提高了不同細胞器的分離效率，并且某些分離方法能夠有效提取不同的亞細胞組分。Herrnstadt C等［1］利用免疫磁珠分離純化法分離到高純度的線粒體，后來該分離方法得到了廣泛應(yīng)用，高爾基體、過氧化物酶體、囊泡等亞細胞結(jié)構(gòu)也相繼被分離純化。有時對于密度相近的細胞器，可通過與其他介質(zhì)混合使其密度間有顯著差異。例如，在提取質(zhì)膜亞細胞組分時，可用陽離子硅膠包被質(zhì)膜，使其與其他細胞器密度差異明顯，然后通過密度梯度離心使細胞質(zhì)膜得到高度純化。Abdolzade－Bavil A等［2］研制出基于微分洗滌劑分餾分離方法（DDF）的蛋白提取試劑盒，分離的亞細胞蛋白組分經(jīng)2－D電泳，形態(tài)學、免疫學和酶促反應(yīng)分析顯示出具有較高的效率和選擇性。用此方法提取保存多年的冰凍組織中的亞細胞結(jié)構(gòu)組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白組覆蓋率和蛋白定位信息幾乎沒有損失。也有人報道了利用洋地黃皂苷和去垢劑從培養(yǎng)的哺乳動物細胞液中分別提取濃縮到細胞質(zhì)基質(zhì)，胞膜和核以及一些不溶性蛋白，經(jīng)后續(xù)試驗驗證提取效果較好。Kislinger T等［3］結(jié)合亞細胞器分離技術(shù)以及基于鳥槍測序的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測實驗小鼠不同組織的4個主要細胞器蛋白含量，利用嚴格的統(tǒng)計篩選和機器識別方法，共鑒定到4 768種蛋白，其中3 274種蛋白得到確切的亞細胞定位，包括1 503種未知特征蛋白，然而通過比較之前報道的mRNA表達模式評估了這些蛋白的組織選擇性。該成果可為主要動物模型的組織和器官表達蛋白組提供可靠的參考。亞細胞結(jié)構(gòu)的生物學特性決定了單獨使用一種分離方法分離不同亞細胞器蛋白質(zhì)組效果往往不理想，亞細胞結(jié)構(gòu)的分離純化仍然是亞細胞蛋白組學研究的一大挑戰(zhàn)。

對分離的亞細胞蛋白組分進行純度鑒定是亞細胞蛋白質(zhì)組學研究必不可少的步驟，通常結(jié)合形態(tài)學和生化方法驗證提取蛋白的純度。目前，進行純度評價的方法包括利用電子顯微鏡觀察亞細胞結(jié)構(gòu)，明確是否有其他組分污染；利用Western blot方法測定目的細胞器標志酶含量和可疑污染細胞器的標志酶含量，兩者的比值即為目的細胞器相對于整個勻漿液中的富集程度；利用特異性抗體檢測細胞器中特異性蛋白從而評價亞細胞成分的純度。Foster L J等［4］通過對肝臟細胞分離的亞細胞組分標記酶或標記蛋白的鑒定分析，驗證了分離的蛋白組分別來之于相應(yīng)的10個不同亞細胞器。近年來，Andreyev A Y等［5］從 RAW264.7細胞中提取6種亞細胞組分（細胞核，線粒體，細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和微粒體），通過定量LC－MS蛋白組學技術(shù)鑒定了50種各細胞器的標記酶來評價各亞細胞組分分離的純度。

2 亞細胞蛋白質(zhì)組

2.1 細胞膜

細胞膜含有特定的蛋白受體，成為藥物設(shè)計的靶標，現(xiàn)已知細胞膜蛋白占整個藥物靶標的70%左右。細胞膜蛋白因其具有兩性特征而難以提取、溶解和分離?？墒走x用甲醇與碳酸氫氨抽提跨膜蛋白后再加入生物素標記的半胱氨酸對膜蛋白進行親和純化，可有效抽提膜蛋白。蛋白組學技術(shù)的發(fā)展促進了細胞膜表達蛋白組的研究。Han C L等［6］應(yīng)用凝膠輔助消化法結(jié)合iTRAQ標簽的定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)定量膜蛋白，共鑒定到520種膜蛋白，該法能從提取膜組分的19個TM螺旋的完整膜蛋白中檢測到跨膜肽段（TM）。細胞膜上含有疾病相關(guān)生物標記物，利用蛋白組學技術(shù)對細胞膜蛋白進行分析，可找出疾病相關(guān)膜靶蛋白。Oh P等［7］對正常和患乳腺癌大鼠的肺泡上皮細胞的細胞膜進行了差異蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)12種差異蛋白在腫瘤肺泡上皮細胞膜表達上調(diào)，后來將抗膜聯(lián)蛋白A1抗體注射到腫瘤大鼠后發(fā)現(xiàn)患病大鼠腫瘤發(fā)生了遷移，此項研究表明膜聯(lián)蛋白A1為腫瘤標記物。近幾年利用亞細胞蛋白組學技術(shù)尋找人類癌癥相關(guān)生物標記物眾多研究報道中，提取細胞膜等亞細胞組分常作為必須考慮的研究對象。為鑒定與人類肝癌相關(guān)的有意義蛋白標記物，Lee Y Y等［8］提取肝癌細胞的細胞膜、胞質(zhì)、核和細胞骨架等亞細胞組分，利用凝膠電泳結(jié)合液相色譜分離－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)共鑒定到3 045個差異蛋白點，用PLGEM統(tǒng)計分析法區(qū)分差異表達蛋白發(fā)現(xiàn)有21個蛋白可能與肝癌有關(guān)。通過進一步的Western blot、免疫熒光分析和免疫組化方法證實HCC、MATR3、LETM1、ILF2和IQGAP2等5種蛋白與肝細胞癌變過程有關(guān)，可作為肝癌細胞的分子標記物。Burong L等［9］提取人類肺腫瘤和周圍正常肺組織細胞膜蛋白進行2－D電泳分離，經(jīng)MALDI－TOF－MS分析，鑒定了19個差異蛋白點，其中12個蛋白上調(diào)，7個蛋白下調(diào)，再經(jīng)RTPCR與Western blot驗證了下調(diào)蛋白CTSD和上調(diào)蛋白HSP60，生物信息學分析推測這2個蛋白可作為診斷和治療肺癌以及解釋其致病機理的生物候選標記。隨著更多的細胞膜蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立，將有更多的疾病相關(guān)生物標記物被發(fā)現(xiàn)。

2.2 線粒體

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，有細胞“動力工廠”之稱。根據(jù)人類基因組序列估計線粒體蛋白大約有1 000～2 000種，已有700多種線粒體蛋白得到鑒定，其中只有13種線粒體蛋白是由線粒體自身DNA編碼。研究者構(gòu)建了許多不同物種線粒體蛋白表達譜和描述線粒體蛋白分類，功能及相互作用的數(shù)據(jù)庫［10］。早前有人報道利用蛋白組學技術(shù)建立的人類胎盤組織線粒體蛋白質(zhì)表達圖譜，只鑒定出46種蛋白。后來Taylor S W等［11］采用SDS－PAGE分離人心肌線粒體蛋白后進行蛋白組學分析，共鑒定出615種蛋白，其中與氧化磷酸化相關(guān)蛋白占90%以上。對線粒體進行大規(guī)模的蛋白組學分析可以獲得多種蛋白變化信息從而有助于揭示線粒體代謝紊亂疾病的致病機理。Spahr C S等［12］采用蒼術(shù)苷隔離線粒體引起轉(zhuǎn)運孔復(fù)合物（PTPC）開放，結(jié)果鑒定出79種已知蛋白，其中21種蛋白與人表達序列標簽（EST）相配，還發(fā)現(xiàn)其中一些蛋白質(zhì)與細胞凋亡相關(guān)。Palmfeldt J等［13］等為揭示乙基丙二酸腦?。‥E）的致病機制，從EE患者的皮膚成纖維細胞提取線粒體與正常皮膚作蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)有7個線粒體蛋白差異表達顯著，其中乙醛脫氫酶X（ALDH1B）和細胞凋亡因子（AIFM1）與細胞解毒機能和凋亡有關(guān)。Chen Y J等［14］鑒定了胰腺腫瘤組織中與腫瘤生長相關(guān)的線粒體蛋白L28（MRPL28）和L12（MRPL12），經(jīng)后續(xù)試驗發(fā)現(xiàn)這些蛋白能降低線粒體活力，增加糖酵解，體外抑制細胞成長，體內(nèi)促進細胞生長，進而推測非原癌基因突變引起的線粒體代謝改變可能是調(diào)控腫瘤細胞耗氧量的重要機制。Roxo－Rosa M等［15］比較正常人與鼻囊性纖維化病人（CF）的鼻細胞線粒體蛋白組學變化，發(fā)現(xiàn)與機體慢性炎癥和氧化應(yīng)激損傷的蛋白差異表達顯著，而線粒體蛋白的低水平表達表明CF鼻細胞線粒體代謝發(fā)生了改變。

2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的主要功能是參與蛋白質(zhì)合成、修飾與加工、新生肽鏈的折疊、組裝和運輸，還具有合成膜脂、調(diào)節(jié)血糖和鈣離子濃度的作用。對亞細胞器的結(jié)構(gòu)蛋白組學研究能獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)復(fù)合物的生化和細胞功能信息。Knoblach B等［16］對小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行蛋白組學分析，結(jié)果鑒定了141個蛋白斑點，其中6個未知蛋白，新發(fā)現(xiàn)的2種蛋白命名為ERp19和ERp46，氨基酸序列分析表明ERp19和ERp46分別含有1個和3個硫氧還原序列，為硫氧還原蛋白家族成員，隨后的Western blot和Northern blot試驗表明，與其他組織比較，肝臟中這2種蛋白和其相應(yīng)的mRNA表達水平均上調(diào)，亞細胞定位顯示這2種蛋白都富集于肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡內(nèi)，利用酵母遺傳互補試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERp46具有PD（二硫化物異構(gòu)酶）功能，而ERp19則沒有。為明確生理與病理狀態(tài)下胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白組學情況，Chen X等［17］利用iTRAQ 標簽結(jié)合2DLC－MALDI－MS／MS蛋白組學技術(shù)定量比較患急性胰腺炎（AP）和正常大鼠胰腺中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白組學變化，共鑒定到469個差異蛋白點，這些蛋白歸類于核糖體蛋白，易位子，分子伴侶，分泌性蛋白和脂質(zhì)酶類。共有37種表達顯著差異的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白包括消化酶類和翻譯調(diào)節(jié)因子，在細胞凋亡過程中具有重要生物學意義，而分子伴侶蛋白則變化輕微，進一步的分析發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎中Erp27、甘油三酯脂肪酶前體、和脯氨酰4－羥化酶3種蛋白表達下調(diào)，纖維蛋白原α、β和γ鏈表達顯著上調(diào)，這些結(jié)果表明細胞凋亡早期其粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白變化可能影響消化酶的合成與加工。

2.4 高爾基體

高爾基體是由許多扁平囊泡構(gòu)成，其功能是將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成的蛋白質(zhì)進行加工，修飾，分類并呈送到細胞特定部位或分泌到細胞外。同時高爾基體也參與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，在細胞凋亡過程中扮演重要角色。根據(jù)人基因組序列預(yù)計有1 000種高爾基體蛋白，但只有200種蛋白得到鑒定。關(guān)于哺乳動物高爾基體表達蛋白組學研究能夠鑒定出亞細胞組分中新的蛋白質(zhì)。Bell A W 等［18］采用 TritonX－114對純化的鼠肝臟高爾基體蛋白分級后經(jīng)SDS－PAGE分離，再經(jīng)PMF和MS／MS分析共鑒定出81個蛋白，其中49個為含有跨膜區(qū)的整合膜蛋白，鑒定出的蛋白以高爾基駐留蛋白和膜轉(zhuǎn)運蛋白為主；此外還發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為34ku新的高爾基體相關(guān)蛋白質(zhì)GPP34，該蛋白隨后被研究者廣泛研究并作為高爾基體轉(zhuǎn)運蛋白家族的新成員。此外Wu C C等［19］對大鼠不同狀態(tài)下乳腺上皮細胞高爾基體進行蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)大鼠處于最大分泌時30種蛋白表達上調(diào)，這些上調(diào)蛋白屬于調(diào)控蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白和信號傳導(dǎo)蛋白類。許多關(guān)于高爾基體的蛋白組學研究揭示了高爾基體具有精氨酸甲基化功能，后來Wu等對大鼠高爾基體進一步分析，利用MudTIP技術(shù)共鑒定了421個蛋白質(zhì)，其中一個推測為甲基轉(zhuǎn)移酶，進一步分析發(fā)現(xiàn)在高爾基體中有18個蛋白質(zhì)是精氨酸二甲基化的；接著Wu等又設(shè)計甲基化活性試驗進行了驗證，他們用甲硫氨酸和Triton－100溶液孵育高爾基體蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定出3種甲基化蛋白。對不同生物體及不同生理、病理狀態(tài)高爾基體的蛋白質(zhì)組學研究將會進一步加深對高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的認識。Chen X等［20］為發(fā)現(xiàn)子代高爾基體合成需要細胞分裂時母代高爾基體分解和重新裝配的內(nèi)在分子機制，采用iTRAQ標簽的定量蛋白組學技術(shù)檢測和分析大鼠有絲分裂間期和分裂期高爾基體膜的差異蛋白組，共有1193個蛋白點得到鑒定，這些蛋白歸類于高爾基體結(jié)構(gòu)蛋白、高爾基體駐留酶、SNAREs、Rab GTPases和細胞骨架蛋白；有86個蛋白經(jīng)Western blot驗證在有絲分裂間期和分裂期表達差異顯著且有生物學意義，推測這些蛋白與細胞周期高爾基體的分解和從新裝配有關(guān)。隨著亞細胞器分離技術(shù)和純化技術(shù)的發(fā)展，對不同生物體及不同生理、病理狀態(tài)高爾基體的蛋白質(zhì)組學研究將會進一步促進對高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的認識。

2.5 細胞核

細胞核是遺傳物質(zhì)儲存和復(fù)制的場所，是細胞遺傳性和代謝活動的控制中心，在細胞的代謝、生長和分化中起著重要作用。Schirmer E C等［21］提取肝臟的核膜蛋白利用差減蛋白組學技術(shù)共鑒定了80個蛋白質(zhì)，其中13個為已知核膜蛋白，67個為新蛋白，通過免疫定位試驗發(fā)現(xiàn)其中8個定位于核膜，其余59個蛋白尚需進一步的功能和定位分析。對核孔復(fù)合體蛋白質(zhì)組成分析有利于對其轉(zhuǎn)運機制的認識。Rout M P［22］等借助不同緩沖體系和蔗糖密度梯度離心分離到高純度的酵母核孔復(fù)合體蛋白，經(jīng)鑒定得到174個蛋白，其中34個未知蛋白質(zhì)，這些未知蛋白的發(fā)現(xiàn)對于研究核孔復(fù)合體在核內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運的作用有重大意義。目前很多動物遺傳疾病與核膜和核孔復(fù)合物的結(jié)構(gòu)異常有關(guān)，核膜與核孔復(fù)合物聯(lián)系緊密。對核膜的比較蛋白組學研究發(fā)現(xiàn)鑒定到很多蛋白具有明顯的序列特性，而且這些蛋白質(zhì)對于核孔復(fù)合物行使其功能具有一定作用，特別是核膜組分富集的蛋白質(zhì)中含有苯丙氨酸－甘氨酸重復(fù)序列影響著核轉(zhuǎn)運功能［23］。利用蛋白組學技術(shù)尋找和鑒定與細胞核相關(guān)的疾病生物標記物也得到了廣泛研究。McKinney K Q等［24］等對人的胰腺癌細胞和正常胰腺細胞核進行了差異蛋白組學分析，共鑒定到2393個差異蛋白點，利用PLGEM統(tǒng)計分析有104個蛋白與胰腺癌有關(guān)，其中一種重要的細胞凋亡抑制因子PEDF，免疫熒光定位試驗表明該標記物在胰腺癌細胞核中大量表達，而在正常胰腺細胞胞質(zhì)中大量表達，推測可作為人類胰腺癌診斷標記。核仁是細胞核內(nèi)核糖體產(chǎn)生區(qū)域，介導(dǎo)核糖體生物發(fā)生和rRNA合成。Andersen J S［25］從HeLa細胞中提取核仁蛋白，鑒定的692個蛋白為核蛋白，鑒定出的蛋白能與90%已知酵母核蛋白相匹配，表明核仁蛋白高度保守。剪接體是位于胞核的多蛋白復(fù)合物，主要功能是執(zhí)行前mRNA內(nèi)含子的剪切。關(guān)于剪接體的亞細胞蛋白組學研究相對較少，但有報道指出利用親和層析法分離得到高純度的活性剪接體，接著通過蛋白組學技術(shù)共鑒定到145個剪接體蛋白，其中包含58個新的剪接體蛋白。

2.6 其他細胞器

中心體是動物細胞的微管組織中心，它通過對細胞骨架的影響參與細胞形狀，極性和運動，且在細胞的分裂增殖中扮演重要作用。Andersen J S等［26］首次運用SDS－PAGE結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜方法對人中心體進行了研究，利用蛋白質(zhì)校正譜圖分析法確證中心體蛋白，并建立了中心體定位蛋白在五個密度梯度組分中肽段豐度與峰面積蛋白相關(guān)圖譜，運用PCP技術(shù)找到137種中心體相關(guān)組分，隨后利用免疫熒光方法驗證了23種新的中心體蛋白質(zhì)，同時，還找到了一些與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，如ALMS1蛋白。為了弄清中心體結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系的分子機理，最近Jakobsen L 等［27］利用PCP－SILAC質(zhì)譜技術(shù)對人細胞中心體作了蛋白組學研究，這些蛋白組數(shù)據(jù)進一步促進中心體蛋白的功能分析。中間體為在細胞分裂期出現(xiàn)的來自于中心紡錘體的結(jié)構(gòu)，其參與細胞的有絲分裂，一般出現(xiàn)在2個子代細胞即將分裂前的連接處。Skop A R等［28］對哺乳動物中間體進行蛋白組學研究，鑒定了160種候選中間體蛋白質(zhì)，運用免疫熒光試驗證實10種蛋白定位于中間體，為了明確這些蛋白是否參與細胞有絲分裂，利用RNA干涉試驗顯示80種蛋白與細胞有絲分裂有關(guān)，進一步研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白GRP94參與了細胞染色體分離。

3 亞細胞蛋白質(zhì)組發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)及展望

近年來，亞細胞蛋白質(zhì)組學取得了長足的進展，但同樣也面臨諸多挑戰(zhàn)，一是高純度亞細胞器的獲得，二是低豐度蛋白的鑒定及鑒定出的蛋白亞細胞的真實定位。目前，利用各種物理、化學或生物的方法都很難提取分離到絕對純度的亞細胞結(jié)構(gòu)，分離的蛋白很難100%確定來自于目標亞細胞結(jié)構(gòu)。另外，有些蛋白質(zhì)并不是固定存在于單個亞細胞位置上，而是動態(tài)的在多個亞細胞位置間轉(zhuǎn)運，所以對于這種動態(tài)分布的蛋白質(zhì)是混合污染還是有定位變化尚需進一步研究。隨著差減蛋白質(zhì)組方法、蛋白質(zhì)校正圖譜、FFE、免疫純化技術(shù)、FAOS、LOPIT、PCP等方法的引入，以及生物信息學軟件對蛋白亞細胞定位的預(yù)測，分離得到的亞細胞器純度正在逐步提高，得到的亞細胞組分數(shù)據(jù)也越來越可靠?？梢灶A(yù)見的是，由于整個細胞的蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，隨著技術(shù)的發(fā)展，比較亞細胞蛋白質(zhì)組學將成為一個新的發(fā)展方向。

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