細胞培養(yǎng)工藝條件對抗體異質性影響的研究進展

段須杰，劉睿，徐衛(wèi)濤，任彤，羅厚勇

江蘇先聲藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210042

抗體藥物具有靶向明確、副作用小等優(yōu)勢，受到國內外藥企的廣泛關注。迄今為止，F(xiàn)DA和EMA批準的抗體藥物共有35個，雖然數(shù)量不多，但卻占據(jù)2012年全球十大暢銷藥物市場的半壁江山[1-2]。隨著眾多“重磅炸彈”藥物的專利即將到期，生物仿制藥也受到全球制藥行業(yè)的青睞[3]。

放眼國內抗體開發(fā)領域，競爭和矛盾似乎更加激烈和突出。由于靶點研究和抗體篩選技術國內實力與國際水平差距較大，因此國內對抗體藥物的開發(fā)主要集中在生物仿制藥領域。盡管EMA和FDA已公布抗體藥物仿制指導原則和指導意見草案，但 CFDA尚未頒布關于生物仿制藥的指導原則[4-5]。因此，國內眾多醫(yī)藥企業(yè)和生物技術公司對于生物仿制藥的研究仍處于摸索階段。

眾所周知，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和抗體質量分析已然成為我國的抗體藥物產業(yè)化的主要限制因素。近年來，盡管國內抗體藥物的表達水平有所提高 (1～2 g/L)，但與國際水平 (3～5 g/L)仍有一定的差距。然而，國內企業(yè)對于抗體的質量研究仍沒有足夠的關注度，工藝優(yōu)化仍以抗體產量為導向。尤其是對于動物細胞培養(yǎng)條件而言，對抗體質量的影響非常顯著，如何有效地通過控制培養(yǎng)工藝來滿足抗體藥物 (特別是生物仿制藥)開發(fā)要求成為迫在眉睫的問題。因此，本文將重點關注近年來國際上抗體研發(fā)的最新報告，著重介紹細胞培養(yǎng)工藝條件對抗體異質性影響的研究進展，以期對國內藥企進行抗體研發(fā)起到指導作用，并對未來抗體藥物研發(fā)趨勢進行展望。

1 抗體結構與功能

1.1 抗體結構

抗體基本結構是由四肽鏈構成的單體，即由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過二硫鍵連接，呈Y字形。完整抗體的分子量約為150 kDa，單個重鏈和單個輕鏈的分子量分別為50 kDa和25 kDa。按照結構域可將輕重鏈和輕鏈分為可變區(qū)和恒定區(qū)。在輕重鏈的可變區(qū)各有 3個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序高度變化，稱為互補決定區(qū) (Complementarity determing region，CDR)。Fab片段表示抗體與抗原的結合片段 (Antigenbinding fragment)，由一條完整的輕鏈和部分重鏈組成。Fc片段為可結晶片段 (Crystallizable fragment)，包括重鏈的恒定 2區(qū)和 3區(qū)，該部分無抗原結合活性，是抗體分子與效應分子或細胞相互作用的部位，發(fā)揮多種生物學效應。

1.2 抗體功能

單克隆抗體藥物的作用機制主要分為 3種：1) 通過Fab片段與相應抗原特異性結合；2) 通過Fc片段與細胞表面Fc受體結合，發(fā)揮多種生物學作用，包括抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)效應，調理作用，I型超敏反應等；3)通過 Fc片段激活補體，產生補體依賴的細胞毒性作用 (Complement-dependent cytotoxicity，CDC)效應[6]。

2 抗體異質性

抗體在生產過程中由于受到復雜培養(yǎng)環(huán)境的影響，諸如酶解反應或者自發(fā)性降解，都會造成抗體的異質性，而這種異質性必須通過質量研究進行衡量，以保證產品的完整性和生產過程的一致性?？贵w的異質性主要體現(xiàn)在翻譯后修飾和降解，主要包括糖基化、C末端降解、天冬酰胺脫氨基、天冬氨酸異構化、甲硫氨酸氧化等。

2.1 糖基化

糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾，指在酶的催化下糖鏈被接到肽鏈上的特定糖基化位點。對于抗體而言，主要是 N連接的糖基化(N-linked glycosylation)。糖基化的異質性主要體現(xiàn)在兩個方面：1)糖基化位點是否存在糖鏈；2)糖基化位點存在的糖鏈是何種類型。抗體的糖基化過程十分復雜，起始于內質網，結束于高爾基體，涉及多種核苷酸前體、糖以及糖基轉移酶。研究表明，抗體的糖基化特點將直接影響到Fc片段的3D構象及功能[7-9]。

2.2 C末端降解

對于IgG而言，重鏈的C末端是賴氨酸 (K)殘基，而胞內的羧肽酶通常會將賴氨酸殘基脫去，但這種酶解往往不完全，因此抗體中往往呈現(xiàn)出多種脫K異構體 (0K，1K和2K)。截止到目前為止，研究表明賴氨酸異構體不會對藥物的有效性和安全性產生影響，同時賴氨酸殘基的去除也不會對CDC效應產生影響[10-11]。

2.3 脫氨基和異構化

天冬酰胺脫氨基和天冬氨酸異構化也是蛋白降解的主要原因，通常在溫和的環(huán)境中便可發(fā)生[12]。天冬酰胺脫氨基后會生成琥珀酰亞胺，后者水解后生成天冬氨酸和異天冬氨酸的混合物?？贵w的脫氨基主要發(fā)生在兩個區(qū)域：CDR區(qū)和Fc片段特定的氨基酸序列。其中，CDR區(qū)域的脫氨基將直接影響到抗體和抗原的親和力，而Fc片段的脫氨基尚未有其對抗體功能影響的報道[6]。天冬酰胺脫氨基和天冬氨酸異構化在抗體的整個生命周期都存在，包括注射進入人體后[13]。研究表明，抗體制劑在儲存過程中，諸如高溫和pH都將會增加蛋白降解的程度，因此選擇一個合適的制劑處方和保存溫度都將有效地控制抗體的降解[10]。

2.4 氧化

氧化也是一種常見的蛋白翻譯后修飾。被氧化的氨基酸主要包括甲硫氨酸、半胱氨酸和色氨酸，其中甲硫氨酸氧化在細胞培養(yǎng)、純化、制劑以及儲存過程中都有可能發(fā)生[14]。Bertolotti-Ciarlet等第一次報道了甲硫氨酸氧化對 Fcγ受體和新生兒受體 (FcRn)的影響。研究結果顯示，甲硫氨酸氧化使得抗體對 FcγRIIa的親和力略有下降，而與FcRn的親和力明顯下降[15]。此外，甲硫氨酸氧化還會導致抗體的穩(wěn)定性降低，免疫原性增加，以及體內的半衰期減少等[6]。

2.5 游離巰基

抗體通常包括多組鏈內和鏈間的二硫鍵。采用哺乳動物細胞表達的抗體可能會存在游離巰基，而游離巰基的存在會破壞抗體結構，進而對藥物的有效性產生影響。Chaderjian等研究表明，可以通過改變細胞培養(yǎng)工藝 (添加硫酸銅)降低游離巰基水平達10倍以上[16]。

2.6 糖化

糖化是指糖類的還原基團與蛋白質的氨基發(fā)生的非酶催化反應。由于糖化位點分布在整個抗體分子，沒有潛在糖化位點，因此發(fā)生糖化而導致的質量問題比較少見。Yuk等研究發(fā)現(xiàn)，在細胞培養(yǎng)過程中，較高的葡萄糖濃度可能會增加抗體的糖化程度，進而對藥物的安全性、有效性以及穩(wěn)定性產生影響，可以通過降低糖濃度的辦法達到控制抗體的糖化程度[17]。

3 細胞培養(yǎng)工藝條件對抗體質量的影響

細胞培養(yǎng)工藝作為抗體生產過程中的重要環(huán)節(jié)，對最終抗體質量影響十分顯著。由于哺乳動物細胞培養(yǎng)對于培養(yǎng)環(huán)境的要求非?？量?，同時對表達抗體的質量要求極其嚴格，因此如何通過工藝條件優(yōu)化達到產品的質量要求顯得尤為關鍵。通常，培養(yǎng)環(huán)境包括營養(yǎng)物 (培養(yǎng)基)、培養(yǎng)條件 (溫度、pH、溶解氧、攪拌轉速)、代謝物 (乳酸、氨、CO2)、培養(yǎng)周期以及培養(yǎng)方式、培養(yǎng)規(guī)模等。下面本文將重點闡述上述因素對抗體質量的影響。

3.1 培養(yǎng)基

動物細胞培養(yǎng)基成分復雜，種類繁多，但大體可分為碳源 (糖類、谷氨酰胺)、氮源 (氨基酸)、維生素、無機鹽、微量元素、脂類、核苷類和其他物質等。培養(yǎng)基成分對抗體質量影響的研究主要集中在糖基化方面，影響因素包括糖類、微量元素、寡糖前體以及誘導劑等。

Tachibana等發(fā)現(xiàn)，采用果糖、甘露糖、半乳糖來代替葡萄糖對抗體糖基化水平產生顯著影響，主要與細胞對不同種類糖的利用效率以及不同的糖代謝途徑有關[18]。Nyberg和 Wong等研究認為，缺乏葡萄糖和谷氨酰胺不僅會造成糖基化位點的減少，同時會對糖型結構產生改變[19-20]。產生這種現(xiàn)象的主要原因是葡萄糖和谷氨酰胺的匱乏造成胞內 UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)濃度降低，因而無法進行后續(xù)的糖基化修飾，最終出現(xiàn)唾液酸化水平降低 (降低抗體的抗炎能力)，高甘露糖型比例升高 (降低抗體體內的半衰期)[21-22]。另外，Gramer等在工藝轉接過程中發(fā)現(xiàn)抗體的半乳糖基化水平發(fā)生明顯改變，并通過在培養(yǎng)基中添加尿嘧啶、氯化錳和半乳糖實現(xiàn)對抗體糖基化的改變[23]。

在糖基化過程中，金屬離子在眾多糖基轉移酶中起到重要作用，諸如錳離子、鈷離子、鈣離子、鋅離子、銅離子等[24-26]。Crowell等研究發(fā)現(xiàn)，錳離子的添加可以增加糖基化位點，并減少糖鏈分支[24]。而Pacis等則通過添加氯化錳顯著降低抗體高甘露糖型的比例[27]。此外，培養(yǎng)基中添加氯化銅也可以增加糖蛋白的唾液酸含量[26]。

丁酸鈉作為一種誘導劑，常添加至培養(yǎng)基中用于提高抗體產量，同時丁酸鈉的加入對抗體的糖基化水平也會產生影響。Borys等通過添加丁酸鈉可以顯著降低 N-羥乙?；窠洶彼?(Neu5Gc)的含量，由于 Neu5Gc在人體內并不表達，因此Neu5Gc 含量的降低將會降低藥物的免疫原性[28]。此外，Jenkins等發(fā)現(xiàn)添加牛血清白蛋白和脂類顯著增加糖基化水平，可能是由于脂類的添加有利于糖基化修飾的進行[29]。

3.2 培養(yǎng)溫度

培養(yǎng)溫度對抗體質量影響主要體現(xiàn)在 3個方面：糖基化、C末端降解和脫氨基。溫度對糖基化的影響被認為與細胞生長狀態(tài)有關[10]。研究者認為，低溫有利于細胞保持較高的活率，而高活率的細胞有利于抗體糖基化修飾的進行。Ahn等研究發(fā)現(xiàn)，降低培養(yǎng)溫度將降低EPO的唾液酸含量，主要是由于寡糖前體UDP-GlcNAc和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖 (UDP-GalNac)在低溫下胞內濃度較低造成[30]。Borys等進一步研究發(fā)現(xiàn)，在接近細胞生長穩(wěn)定期降溫比在對數(shù)期降溫能夠獲得更低的Neu5Ac含量[28]。

Dick等考察了補料策略和培養(yǎng)溫度對C末端降解的影響。他們認為，溫度改變可以影響抗體的等電點，主要是由于C末端降解造成電荷分布改變。進一步研究發(fā)現(xiàn)，可能是由于細胞培養(yǎng)過程中不同溫度下羧肽酶B的活性不同所造成[31]。段須杰等研究發(fā)現(xiàn)，通過降低培養(yǎng)溫度可以降低C末端降解，從而保證仿制藥與原研藥電荷分布的一致性[32]。

3.3 pH

pH對于抗體質量的影響主要在糖基化修飾方面。Müthing等發(fā)現(xiàn)當pH 7.4時可以獲得完全的半乳糖基化，而在 pH 6.9時唾液酸化程度最低[33]。然而Yoon等則發(fā)現(xiàn)了截然相反的現(xiàn)象，隨著pH的升高 (6.8～7.8)，唾液酸化程度由68%降至40%[34]。pH對糖基化的影響主要是由于改變了高爾基體內的 pH值，進而影響到半乳糖轉移酶(GalT)和唾液酸轉移酶 (SiaT)的酶活。

與此同時，細胞代謝產物如氨和 CO2對于糖基化的影響也與pH聯(lián)系緊密。Gawlizek等發(fā)現(xiàn)，通過增加培養(yǎng)基中的銨離子濃度會降低蛋白的半乳糖基化和唾液酸化，最高可達 40%。其可能原因也是由于銨離子濃度影響到高爾基體內的 pH值，進而對GalT和SiaT酶活產生影響[35]。

Schmelzer和Miller系統(tǒng)考察了CO2分壓和滲透壓對抗體電荷分布和糖基化的影響[36]。研究表明，滲透壓增高對于抗體的電荷分布影響較為顯著。在滲透壓一定 (320 mOsm/kg)的前提下，提高CO2分壓將增加半乳糖基化；而保持CO2分壓(5.32×103Pa)不變，滲透壓的提高會降低半乳糖基化和甘露糖比例。然而，Pacis等則發(fā)現(xiàn)滲透壓的增高會顯著提高高甘露糖的比例，與此同時，G0F和G1F等其他糖型比例相應減少[27]。

3.4 溶氧水平

溶氧水平是細胞培養(yǎng)過程中一個關鍵控制參數(shù)，合適的溶氧水平是細胞生長和抗體合成的重要保證。Trummer等研究發(fā)現(xiàn)高溶氧水平 (100%)會降低糖蛋白的唾液酸含量，而在10%～90%溶氧范圍內對唾液酸含量沒有影響[37]。相反，Chotigeat等發(fā)現(xiàn)隨著溶氧水平的提高 (10%～90%)，唾液酸含量逐漸增加[38]。與此同時，Kunkel等試驗結果表明，提高溶氧水平可以提高抗體的半乳糖基化水平，可能是由于胞內UDP-半乳糖濃度隨著溶氧水平的提高而增加導致[39]。盡管半乳糖基化程度的差異對于抗體的功能 (如 ADCC和 CDC效應)沒有顯著影響，但在進行生物仿制藥研發(fā)過程中，保證仿制藥與原研藥糖基化水平的一致性也非常必要[40]。此外，高溶氧水平也會增加甲硫氨酸的氧化程度，而后者將會對抗體的結構和功能產生重要影響[41-42]。

3.5 攪拌轉速

攪拌對于細胞培養(yǎng)至關重要，一方面滿足氣液傳質和混合，同時攪拌所引起的剪切對細胞生長或抗體合成也會產生負面影響。然而關于攪拌對抗體質量影響的研究報道較少。Senger等發(fā)現(xiàn)，攪拌轉速的提高 (40～200 r/min)會造成糖基化位點的減少，可能是由于高剪切條件下，蛋白合成速率較高，蛋白在內質網的停留時間下降所造成[43]。

3.6 培養(yǎng)周期與培養(yǎng)方式

培養(yǎng)周期對于抗體質量的影響主要包括糖基化水平和電荷分布。Pacis等發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)周期的延長，高甘露糖型的比例逐漸增加，而高甘露糖型比例的增加可能會降低藥物在體內的半衰期[27]。Kaneno等在試驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過程中抗體的電荷分布隨著時間發(fā)生改變，因此以電荷分布作為培養(yǎng)結束的判定標準，從而控制產品質量的一致性[44]。段須杰等通過檢測高甘露糖型比例作為控制細胞培養(yǎng)周期的標準，進而滿足抗體的質量要求[32]。

目前細胞培養(yǎng)方式的主流仍為流加培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時間的延長，代謝產物逐漸累積，同時細胞裂解產生的酶逐漸增多，因此抗體質量在復雜的培養(yǎng)環(huán)境容易發(fā)生修飾或降解。特別對于生物仿制藥開發(fā)而言，諸如ReoPro、Remicade等原研藥物由于采用灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境與流加培養(yǎng)差異較大，因此要特別留意培養(yǎng)周期或培養(yǎng)方式對抗體質量產生的影響。

3.7 培養(yǎng)規(guī)模

細胞培養(yǎng)工藝條件通常可以分為兩類：體積依賴性參數(shù) (攪拌，通氣，培養(yǎng)體積)和體積非依賴性參數(shù) (培養(yǎng)溫度，pH，溶氧水平)。因此在工藝放大過程中，需要保持體積非依賴性參數(shù)不變，同時適當?shù)胤糯篌w積依賴性參數(shù)[45]。特別是在大規(guī)模 (＞10 000 L)、高密度細胞培養(yǎng)條件下，氧氣的充分供給和 CO2的及時排出往往成為工藝成功放大的關鍵[46]。由此可見，培養(yǎng)規(guī)模對抗體質量的影響歸根結底還是工藝條件，如何保持在放大過程中工藝條件的一致性成為抗體質量一致性的前提。

4 結語與展望

抗體藥物近年來的迅猛發(fā)展已經得到了國內外藥企和生物技術公司的廣泛關注，特別是“十二五”期間國家已進一步明確將生物醫(yī)藥產業(yè)作為重點發(fā)展的七大戰(zhàn)略性新興產業(yè)之一?！笆濉逼陂g將投入400億人民幣進行重大新藥創(chuàng)制，預計“十三五”期間將再投入 750億元資金進行扶持。與此同時，越來越多的生物藥“重磅炸彈”面臨著“專利懸崖”，使得國內生物仿制藥的競爭愈演愈烈。如何權衡抗體產量與質量的關系成為生物仿制藥開發(fā)的關鍵。由于抗體本身存在異質性，細胞培養(yǎng)環(huán)境通過影響抗體糖基化、電荷分布等翻譯后修飾，進而對抗體的功能產生顯著影響[47-48]。特別對培養(yǎng)基而言，國內大多數(shù)企業(yè)仍以使用商業(yè)化培養(yǎng)基為主，一旦出現(xiàn)產品質量問題，很難對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，如何掌握細胞培養(yǎng)的關鍵技術也是我們國內企業(yè)需要亟待解決的問題。從EMA生物仿制藥指導原則和FDA對生物仿制藥批準指導意見的草案來看，未來國內對生物仿制藥的質量要求會日益嚴格，因此深入認識細胞培養(yǎng)工藝對抗體質量的影響將日益重要。

[1]Therapeutic monoclonal antibodies approved or in review in the European Union or United States [EB/OL].[2013-04-05]. http://antibodysociety.org/news/approved mabs.php.

[2]TOP 20 Best-Selling Drugs of 2012 [EB/OL]. [2013-04-05].http://www.genengnews.com/insight-andintelligence/top-20-best-selling-drugs-of-2012/77899775/?p age=2.

[3]Biosimilar & FOB China 2011 [EB/OL]. [2013-04-05].http://www.bioon.com/z/Biosimilar/Introduction.shtml.

[4]Guideline on similar biological medicinal products containing monoclonal antibodies – non-clinical and clinical issues [EB/OL]. [2013-04-09]. http://www.ema.europa.eu/docs/enGB/document_library/Scientific_guideline/2012 /06/WC50012 8 686.pdf.

[5]Biosimilarity [EB/OL]. [2013-04-09]. http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/uc m290967.htm.

[6]Correia IR. Stability of IgG isotypes in serum. Mabs, 2010,2(3): 221?232.

[7]Raju TS. Terminal sugars of Fc glycans influence antibody effector functions of IgGs. Curr Opin Immunol, 2008, 20(4):471?478.

[8]Biowa website [EB/OL]. [2013-04-11]. http://www.biowa.com.

[9]Eureka Therapeutics website [EB/OL]. [2013-04-09].http://eurekainc.com/.

[10]Vlasak J, Ionescu R. Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods. Curr Pharm Biotech, 2008, 9(6): 468?481.

[11]Antes B, Amon S, Rizzi A, et al. Analysis of lysine clipping of a humanized Lewis-Y specific IgG antibody and its relation to Fc-mediated effector function. Technol Biomed Life Sci, 2007, 852(1/2): 250?256.

[12]Aswas DW, Paranandi MV, Schurter BT. Isoaspartate in peptides and proteins: formation, significance, and analysis.Pharm Biomed Anal, 2000, 97(2): 775?790.

[13]Huang L, Lu J, Wroblewski VJ, et al. In vivo deamination characterization of monoclonal antibody by LC/MS/MS.Anal Chem, 2005, 77(5): 1432?1439.

[14]Harris RJ. Heterogeneity of recombinant antibodies: linking structure to function. Dev Biol (Basel), 2005(0), 122:117?127.

[15]Bertolotti-Ciarlet A, Wang W, Lownes R, et al. Impact of methionine on binding of human IgG1 to FcRn and Fcγ receptors. Mol Immunol, 2009, 46(8/9): 1878?1882.

[16]Chaderjian WB, Chin ET, Harris RJ, et al. Effect of copper sulfate on performance of serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed. Biotechnol Prog, 2005, 21(2): 550?553.

[17]Yuk IH, Zhang B, Yang Y, et al. Controlling glycation of recombinant antibody in fed-batch cell cultures. Biotechnol Bioeng, 2011, 108(11): 2600?2610.

[18]Tachibana H, Taniguchi K, Ushio Y, et al. Changes of monosaccharide availability of human hybridoma lead to alteration of biological properties of human monoclonal antibody. Cytotechnology, 1994, 16(3): 151?157.

[19]Nyberg GB, Balcarcel RR, Follstad BD, et al. Metabolic effects on recombinant interferon-gamma glycosylation in continuous culture of Chinese hamster overy cells.Biotechnol Bioeng, 1999, 62(3): 336?347.

[20]Wong CF, Wong TK, Goh LT, et al. Impact of dymanic online fed-batch strategies on metabolism, productivity and N-glycosylation quality in CHO cell culture. Biotechnol Bioeng, 2005, 89(2): 164?177.

[21]Nimmerjahn F, Ravetch JV. Anti-inflammatory actions of intravenous immunoglobulin. Annu Rev Immunol. 2008,26(1): 513?533.

[22]Goetze AM, Liu YD, Zhang Z, et al. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology, 2011, 21(7):949?959.

[23]Gramer MJ, Eckblad JJ, Donahue R, et al. Modulation of antibody galactosylation through feeding of uridine,manganese chloride, and galactose. Biotechnol Bioeng,2011, 108(7): 1591?1602.

[24]Crowell CK, Grampp GE, Rogers GN, et al. Amino acid and manganese supplementation modulates the glycosylation state of erythropoietin in a CHO culture system. Biotechnol Bioeng, 2007, 96(3): 538?549.

[25]Fujiyama K, Ido Y, Misaki R, et al. Human N-acetylglucosaminyltransferase I. Expression in Escherichia coli as a soluble enzyme, and application as an immobilized enzyme for the chemoenzymatic synthesis of N-linked oligosaccharides. J Biosci Bioeng, 2001, 92(6): 569?574.

[26]Ryll T. Mammalian cell culture process for producing glycoproteins: US, 6528286. 2003-03-04.

[27]Pacis E, Yu M, Autsen J, et al. Effects of cell culture conditions on antibody N-linked glycosylation-what affects high mannose 5 glycoform. Biotechnol Bioeng, 2011,108(10): 2348?2358.

[28]Borys MC, Dalal NG, Abu-Absi NR, et al. Effects of culture conditions on N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)content of a recombinant fusion protein produced in CHO cells.Biotechnol Bioeng, 2009, 105(6): 1048?1057.

[29]Jenkins N, Castro P, Menon S, et al. Effect of lipid supplements on the production and glycosylation of recombinant interferon-gamma expressed in CHO cells.Cytotechnology, 1994, 15(1/3): 209?215.

[30]Ahn WS, Jeon JJ, Jeong YR, et al. Effect of temperature on nucleotide pools and monoclonal antibody production in a mouse hybridoma. Biotechnol Bioeng, 2008, 101(6):1234?1244.

[31]Dick LW, Qiu D, Mahon D, et al. C-terminal lysine variants in fully human monoclonal antibodies: investigation of test methods and possible causes. Biotechnol Bioeng, 2008,100(6): 1132?1143.

[32]Duan XJ, Liu R, Xu WT. Methods for precise control monoclonal antibody quality using fed-batch mode for mammalian cells: CN, 201310055762.7. 2013-02-22. (in Chinese).段須杰, 劉睿, 徐衛(wèi)濤. 采用動物細胞流加培養(yǎng)方式精確控制單克隆抗體產品質量的方法: 中國專利, 申請?zhí)?201310055762.7. 2013-02-22.

[33]Müthing J, Kemminer SE, Conradt HS, et al. Effects of buffering conditions and culture pH on production rates and glycosylation of clinical phase I anti-melanoma mouse IgG3 monoclonal antibody R24. Biotechnol Bioeng, 2003, 83(3): 321?334.

[34]Yoon SK, Choi SL, Song JY, et al. Effect of culture pH on erythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5 and 37.0 degrees C. Biotechnol Bioeng, 2005, 89(3): 345?356.

[35]Gawlitzek M, Ryll T, Lofgren J, et al. Ammonium alters N-glycan structures of recombinant TNFR-IgG: degradative versus biosynthetic mechanisms. Biotechnol Bioeng, 2000,68(6): 637?646.

[36]Schmelzer AE, Miller WM. Hyperosmotic stress and elevated pCO2alter monoclonal antibody charge distribution and monosaccharide content. Biotechnol Prog, 2002, 18(2):346?353.

[37]Trummer E, Fauland K, Seidinger S, et al. Process parameter shifting: Part I. Effect of DOT, pH, and temperature on the performance of Epo-Fc expressing CHO cells cultivated in controlled batch bioreactors. Biotechnol Bioeng, 2006,94(6): 1033?1044.

[38]Chotigeat W, Watanapokasin Y, Mahler S, et al. Role of environmental conditions on the expression levels,glycoform pattern and levels of sialyltransferase for hFSH produced by recombinant CHO cells. Cytotechnology, 1994,15(1/3): 217?221.

[39]Kunkel JP, Jan DC, Jamieson JC, et al. Dissolved oxygen concentration in serum-free continuous culture affects N-linked glycosylation of a monoclonal antibody. J Biotechnol, 1998, 62(1): 55?71.

[40]Raju TS, Jordan RE. Galactosylation variations in marketed therapeutic antibodies. Mabs, 2012, 4(3): 385?391.

[41]Liu H, Gaza-Bulseco G, Xiang T, et al. Structural effect of deglycosylation and methionine oxidation on a recombinant monoclonal antibody. Mol Immunol, 2008, 45(3): 701?708.

[42]Kozlowski S, Swann P. Current and future issues in the manufacturing and development of monoclonal antibodies.Adv Drug Del Rev, 2006, 58(5/6): 707?722.

[43]Senger RS, Karim MN. Effect of shear stress on intrinsic CHO culture state and glycosylation of recombinant tissue-type plasminogen activator protein. Biotechnol Prog,2003, 19(4): 1199?1209.

[44]Kaneko Y, Sato R, Aoyagi H. Changes in the quality of antibodies produced by Chinese hamster ovary cells during the death phase of cell culture. J Biosci Bioeng, 2010,109(3): 281?287.

[45]Li F, Vijayasankaran N, Shen A, et al. Cell culture processes for monoclonal antibody. Mabs, 2010, 2(5): 1?14.

[46]Nienow AW. Reactor engineering in large scale animal cell culture. Cytotechnology, 2006, 50(1/3): 9?33.

[47]Hossler P, Khattak SF, Li ZJ. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology,2009, 19(9): 936?949.

[48]Beck A, Wagner-Rousset E, Bussat MC, et al. Trends in glycosylation, glycoanalysis and glycoengineering of therapeutic antibodyies and Fc-fusion proteins. Curr Pharm Biotech, 2008, 9(6): 482?501.