陸向紅，張秋紅，盧美貞，竇曉，黃晨蕾，賈俊乾，計(jì)建炳

浙江工業(yè)大學(xué) 浙江省生物質(zhì)燃料利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014

眼點(diǎn)擬微綠球藻的培養(yǎng)周期短，油脂產(chǎn)量高，同時(shí)富含花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸等具有保健功能的多不飽和脂肪酸[1]。因此，眼點(diǎn)擬微綠球藻是生產(chǎn)生物柴油和多不飽和脂肪酸的重要原料，值得人們重視和研究。

微藻的生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)量和脂肪酸組成與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系。潘庭雙等[2]研究了NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2、NH4NO3對(duì) N. oculata生長(zhǎng)的影響；Li等[3]報(bào)道了 NaNO3、NH4Cl、CO(NH2)2對(duì) N.oleoabundans 細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂產(chǎn)率的影響；胡章喜等[4]研究了 NO3-、NH4+、CO(NH2)2、氨基酸對(duì)赤潮異彎藻、凱倫藻、球形棕囊藻、角毛藻生長(zhǎng)的影響。前人的研究表明：1)不同的藻種對(duì)氮的種類和濃度需求不同[2-7]；2)微藻最容易利用銨態(tài)氮，銨態(tài)氮有利于微藻油脂積累，但是隨著NH4+被利用，培養(yǎng)液的pH 逐漸下降，抑制微藻的生長(zhǎng)[6]，因而高濃度的銨鹽反而會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)。CH3COONH4是弱酸弱堿鹽，NH4+被吸收利用后，培養(yǎng)液的 pH略有下降，可以高濃度使用。CH3COONH4為氮源對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)、油脂產(chǎn)率和EPA含量方面的研究鮮有報(bào)道，因此，本文研究并比較了 CH3COONH4與其他氮源及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度、油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響，以期篩選出適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)和油脂積累的氮源種類及濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用眼點(diǎn)擬微綠球藻來(lái)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)下屬的海藻種質(zhì)庫(kù) (中國(guó)青島，chl-3)，經(jīng)涂布平板的方法純化之后，保存待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻的擴(kuò)種

按照竇曉等[8]報(bào)道的擴(kuò)種方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻進(jìn)行擴(kuò)種。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1) 藻種的準(zhǔn)備：取4 L培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的眼點(diǎn)擬微綠球藻，按竇曉等[8]報(bào)道的方法得到脫除培養(yǎng)鹽的藻泥，向藻泥中加入100 mL去離子水，振蕩，混合均勻待用。

2) 培養(yǎng)液的配制：在相同的 NaH2PO4·2H2O濃度下，設(shè)計(jì)4組實(shí)驗(yàn)：A組為對(duì)照組，B、C、D組為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組 A的培養(yǎng)液為改良后的F/2[8]；實(shí)驗(yàn)組 B、C、D的培養(yǎng)液分別用CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4替代改良 F/2培養(yǎng)液中的NaNO3，方案見(jiàn)表1。

3) 接種及培養(yǎng)：在1 L的錐形瓶中，按上述設(shè)計(jì)方案配制培養(yǎng)液，將5 mL眼點(diǎn)擬微綠球藻藻液接種至 1 L培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件和方法同竇曉等[8]報(bào)道的一樣。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液中的氮源種類及濃度Table 1 Nitrogen source and concentration in different culture medium

1.3 分析方法

1.3.1 眼點(diǎn)擬微綠球藻細(xì)胞密度及生物量的測(cè)定

按照竇曉等[8]報(bào)道方法測(cè)定眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度。為減小粘附在藻細(xì)胞壁上的培養(yǎng)鹽對(duì)生物量的影響，采收后的藻細(xì)胞用去離子水離心洗滌3次，獲得的藻泥70 ℃烘干至恒重，稱重。為簡(jiǎn)化操作，避免高溫干燥對(duì)油脂及脂肪酸組成的影響，微藻的生物量通過(guò)(1-1)式計(jì)算得到，此式由實(shí)驗(yàn)測(cè)得，其中，y為干重(g/L)，x為吸光度。

1.3.2 眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的測(cè)定

藻液加入硫酸鋁鉀絮凝劑，3 500 r/min離心3 min，棄去上層清液，得到藻泥，采用改良酸法[9]提取微藻中的油脂，利用式(1-2)計(jì)算得到微藻的油脂產(chǎn)率：

式中：LipidY —油脂產(chǎn)率，mg/(d·L)；

CLipid—油脂含量，g/L；T—培養(yǎng)時(shí)間，d。

1.3.3 眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分的分析

按照竇曉等[8]報(bào)道的分析方法對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油成分進(jìn)行定性和定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源種類及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響

圖1結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)所考察的濃度范圍內(nèi)，CO(NH2)2和 CH3COONH4為氮源時(shí)，隨著其濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度增加，當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到 2.00 mmol/L，CH3COONH4濃度增加到5.29 mmol/L后，氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響很小；眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度隨著 NH4Cl濃度的增加，先增加后急劇下降，在2.65 mmol/L時(shí)，生長(zhǎng)密度達(dá)到最大。盡管相比于其他形式的氮，微藻更容易利用銨態(tài)氮，CO(NH2)2和NaNO3[6]必須分別經(jīng)過(guò)水解過(guò)程和還原過(guò)程轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮后才能更好地被利用，銨根離子跟氨在水溶液中存在互相轉(zhuǎn)化，氨在微藻細(xì)胞內(nèi)不能積累過(guò)多，否則會(huì)使微藻中毒，氨中毒使微藻的呼吸作用降低，蛋白質(zhì)合成受阻，進(jìn)而抑制微藻的生長(zhǎng)。因此，任何形態(tài)的氮都存在適宜的氮源濃度。綜合考慮，確定以 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4為氮源培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí)的適宜濃度分別為2.00、2.65和5.29 mmol/L。

以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源做對(duì)比試驗(yàn)，考察氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的影響，其生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。圖 1、2顯示，以 CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間與 NaNO3為氮源時(shí)相近，但比以NH4Cl和CH3COONH4為氮源時(shí)要長(zhǎng)。這主要是因?yàn)殇@態(tài)氮更容易利用，CO(NH2)2和NaNO3的利用必須先分別經(jīng)尿素酶[10-11]和硝酸還原酶[12]酶解后才能被眼點(diǎn)擬微綠球藻利用；以NH4Cl為氮源時(shí)，隨著NH4+的吸收利用，培養(yǎng)液的pH逐漸下降，過(guò)低的pH會(huì)影響代謝中相關(guān)酶的活性，從而抑制微藻的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)密度偏低；而 CH3COONH4是弱堿弱酸鹽，NH4+的利用對(duì)溶液 pH的影響很小。CO(NH2)2的利用雖然要經(jīng)過(guò)水解過(guò)程，生長(zhǎng)速率偏低，但是CO(NH2)2水解后對(duì)培養(yǎng)液的pH影響很小[2]，并且水解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生CO2，能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)[13]；因此相對(duì)于CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知：眼點(diǎn)擬微綠球藻的生物量與其生長(zhǎng)密度成正比。綜上所述，確定 NH4Cl，CO(NH2)2為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)密度較高。由公式(1-1)知：眼點(diǎn)擬微綠球藻CH3COONH4為適于眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)的氮源。

圖1 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.1 Effects of nitrogen source concentration on the growth density of N. oculata. (A)CO(NH2)2. (B)NH4Cl. (C)CH3COONH4.

圖2 氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on the growth density of N. oculata.

2.2 氮源種類及濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

2.2.1 氮源的濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

一般認(rèn)為，氮濃度的增加有利于微藻的生長(zhǎng)，不利于油脂的積累，且積累的脂肪酸主要是飽和脂肪酸[14]。油脂產(chǎn)率是衡量微藻生物柴油經(jīng)濟(jì)性的指標(biāo)，它同微藻的生物量和油脂含量均相關(guān)，因此，最大化油脂產(chǎn)率是提升微藻生物柴油可行性的基本條件[15]。本文以油脂產(chǎn)率和EPA含量為目標(biāo)，考察了氮濃度對(duì)油脂積累和EPA生成的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率隨著CO(NH2)2濃度的增加而增加，當(dāng)CO(NH2)2濃度增加到2.33 mmol/L后，再增加CO(NH2)2濃度對(duì)油脂產(chǎn)率的影響很小；隨著 NH4Cl和 CH3COONH4濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率先增加后下降，NH4Cl和CH3COONH4濃度分別為 2.65 mmol/L 和5.29 mmol/L時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率最高。

表2還顯示氮源濃度也會(huì)影響藻油中的EPA含量，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，CO(NH2)2和CH3COONH4為為氮源時(shí)，藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加先增加后略有下降，當(dāng) CO(NH2)2濃度為2.33 mmol/L，CH3COONH4濃度為5.29 mmol/L時(shí)，EPA含量達(dá)到最高；NH4Cl為氮源時(shí)，藻油中的EPA含量隨著氮源濃度的增加而增加。這與魏東等[16]報(bào)道的結(jié)果相似：在氮缺乏時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻脂肪酸去飽和酶FAD活性下降。

綜合考慮眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量，確定CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4的適宜濃度分別為2.33、2.65、5.29 mmol/L。

2.2.2 氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響

以適宜濃度的 NaNO3、CO(NH2)2、NH4Cl和CH3COONH4為氮源，考察了氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響，其結(jié)果見(jiàn)表3。

結(jié)果顯示，在 4種氮源中，以 NH4Cl和CH3COONH4為氮源，眼點(diǎn)擬微綠球藻具有較高的油脂產(chǎn)率，但以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí)，EPA含量較高，而以CH3COONH4為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率略低于CO(NH2)2為氮源時(shí)的EPA產(chǎn)率。考慮到以 CH3COONH4為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻既有較高的EPA產(chǎn)率，還有較高的油脂產(chǎn)率，這不僅能滿足微藻生物柴油生產(chǎn)的需要，而且在生物柴油生產(chǎn)的同時(shí)還能夠獲得較多的具有高附加值的 EPA，因此確定5.29 mmol/L CH3COONH4為眼點(diǎn)擬微綠球藻積累油脂和EPA的適宜氮源和濃度。

2.3 顯著性分析

從表 4中可以看出氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生物量有顯著影響，氮源濃度對(duì)其生物量的影響不顯著；氮源種類和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的油脂產(chǎn)率都不顯著；眼點(diǎn)擬微綠球藻藻油中的EPA含量與氮源種類和濃度極顯著相關(guān)。因此，培養(yǎng)眼點(diǎn)擬微綠球藻時(shí)，選擇合適的氮源種類和濃度，能夠大幅度地提高藻油中EPA的含量。

3 結(jié)論

氮源的種類和濃度會(huì)影響眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)、油脂積累和EPA的生成。氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)有顯著影響，CH3COONH4為氮源時(shí)，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率快，生物量高，并且隨著其濃度的增加，眼點(diǎn)擬微綠球藻的生長(zhǎng)速率變快，生物量增大。氮源種類和濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率的影響不顯著，但會(huì)對(duì) EPA含量產(chǎn)生顯著影響。以CO(NH2)2和CH3COONH4為氮源時(shí)，EPA含量較高，并且隨著CO(NH2)2和CH3COONH4濃度的增加，EPA含量先增加后略有下降。綜合考慮生長(zhǎng)速率、生物量、油脂產(chǎn)率和EPA含量，選5.29 mmol/L的CO(NH2)2作為眼點(diǎn)擬微綠球藻培養(yǎng)的適宜氮源和濃度。

表2 氮源濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量的影響Table 2 Effects of nitrogen sources concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

表3 氮源種類對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率、EPA含量和EPA產(chǎn)率的影響Table3 Effects of nitrogen sources on the lipid yield, EPA content and EPA yield of N. oculata

表4 CO(NH2)2、NH4Cl、CH3COONH4及其濃度對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻油脂產(chǎn)率和EPA含量影響的方差分析Table 4 Effects of CO(NH2)2, NH4Cl, CH3COONH4 and concentration on the lipid yield and EPA content of N. oculata

[1]Browm MR, Jeffiey SW, Volkman JK, et al. Nutritional properties of microalgae for mariculture. Aquaculture, 1997,151: 315–331.

[2]Pan TS, Hu XJ, Hou GJ, et al. Effect of nitrogen application on the growth of Nannochloropsis oculata. J Anhui Agric Sci,2001, 29(4): 548–555 (in Chinese).潘庭雙, 胡賢江, 侯冠軍, 等. 氮對(duì)微綠球藻生長(zhǎng)的影響.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001, 29(4): 548–555.

[3]Li YQ, Wang B, Wu N, et al. Effects of nitrogen sources on cell growth and lipid accumulation of green alga Neochloris oleoabundans. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81: 629–636.

[4]Hu ZX, Xu N, Duan SS. Effects of nitrogen sources on the growth of Heterosigma akashiw, Karenia sp., Phaeocystis globosa and Chaetoceros sp. Ecol Environ Sci, 2010, 19(10):2452–2457 (in Chinese).胡章喜, 徐寧, 段舜山. 不同氮源對(duì)4種海洋微藻生長(zhǎng)的影響. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2010, 19 (10): 2452–2457.

[5]Zhang QT, Dong SL, Hu GK, et al. Effects of different nitrogen on growth of microalgae. Mar Sci, 2005, 29(2): 8–11(in Chinese).張青田, 董雙林, 胡桂坤, 等. 不同氮源對(duì)微藻增殖的影響.海洋科學(xué), 2005, 29(2): 8–11.

[6]Jiang HM, Gao KS. Effects of nitrogen sources and concentration on the growth and fatty acid composition of Phaeoda-ctylum tricornutum. Acta Hydrobiol Sin, 2004,28(5): 545–551 (in Chinese).蔣漢明, 高坤山. 氮源種類及其濃度對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和脂肪酸組成的影響. 水生生物學(xué)報(bào), 2004, 28(5): 545–551.

[7]Liu PH, Hao ZD, Yang X, et al. Effects of nitrogen sources on growth and total lipid contents of Coelastrum reticulatum and Scenedesums sp.. Ecol Environ Sci, 2012, 21(8): 1429–1433(in Chinese).劉平懷, 郝宗娣, 楊勛, 等. 不同氮源對(duì) 2種微藻生長(zhǎng)及總脂含量的影響. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2012, 21(8): 1429–1433.

[8]Dou X, Lu XH, Lu MZ, et al. Effects of carbon sourse and concentration on the growth density, lipid accumulation and fatty acid composition of Nannochloropis oculata. Chin J Biotech, 2013, 29(3): 358–369 (in Chinese).竇曉, 陸向紅, 盧美貞, 等. 碳源種類及C/N對(duì)眼點(diǎn)擬微綠球藻生長(zhǎng)密度、油脂含量和脂肪酸組成的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(3): 358–369.

[9]Ma S, Fu LL, Wang M, et al. Comparison of extraction methods of crude fat from microalgae. China Oils Fats, 2010,35(5): 77–79 (in Chinese).馬帥, 付莉莉, 汪萌, 等. 從微藻中提取粗脂的方法比較.中國(guó)油脂, 2010, 35(5): 77–79.

[10]Leftley JW, Syrett. Urease and ATP: amidolyase activity in unicellular algae. J Gen Microbiol, 1973, 77: 109–115.

[11]Bekheet IA, Syrett PJ. Urea-degrading enzymes in algae. Br Phycol J, 1977, 12(2): 137–143.

[12]Water Environment Federation. Nutrient Removal, WEF MOP 34. McGraw Hill Professional, 2010: 13–15.

[13]Hu HH, Gao KS. Optimization of growth and fatty acid composition of a unicellular marine picoplankton,Nannochloropsis sp., with enriched carbon sources. Biotechnol Lett, 2003, 25(5): 421–425.

[14]Lin Q, Lin JD. Effects of nitrogen source and concentration on biomass and oil production of a Scenedesmus rubescens like microalga. Bioresour Technol, 2011, 102(2): 1615–1621.

[15]Xu J, Zhang CW, Li AF, et al. Isolation and selection of freshwater microalgae for oil production in south China.Renew Energy Res, 2011, 29(1): 66–71 (in Chinese).許瑾, 張成武, 李愛(ài)芬, 等. 華南地區(qū)淡水產(chǎn)油微藻藻株的分離與篩選. 可再生能源, 2011, 29(1): 66–71.

[16]Wei D, Zhang XC, Sui ZH, et al. Effects of nitrogen sources and N/P ration on cell growth, total lipid content and fatty acid composition of Nannochlopsis oculata. Mar Sci, 2000, 24(7):46–51 (in Chinese).魏東, 張學(xué)成, 隋正紅, 等. 氮源和 N/P對(duì)眼點(diǎn)擬微球藻的生長(zhǎng)、總脂含量和脂肪酸組成的影響. 海洋科學(xué), 2000,24(7): 46–51.