劉皓，楊歡，李雪，李煦，端木勉，于慧敏

1 山東寶莫生物化工股份有限公司，山東 東營 257081

2 清華大學(xué)化學(xué)工程系，北京 100084

由于結(jié)構(gòu)獨特、性能優(yōu)異、環(huán)境友好，微生物合成生物表面活性劑的研究方興未艾。生物表面活性劑在油氣開采、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥農(nóng)藥、化妝品等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景[1-3]。糖脂和脂肽是兩種主要的生物表面活性劑。糖脂 (鼠李糖脂、槐糖脂等)由親水性糖基和疏水性脂肪酸側(cè)鏈構(gòu)成[2-4]。其中，鼠李糖脂的乳化和增溶性能突出[1]，洗油效率和熱穩(wěn)定性較好[1,5]，受到較多關(guān)注[6-7]。表面活性素、芬芥素和伊枯草菌素是由芽胞桿菌產(chǎn)生的3種主要脂肽產(chǎn)物[8-9]，分別由5～10個氨基酸殘基形成的環(huán)肽和一個長鏈脂肪酸側(cè)鏈構(gòu)成。脂肽可降低水的表面張力至 26～27 mN/m，相對于辛烷的界面張力是10?2mN/m，且在75 ℃下至少穩(wěn)定140 h[1]，可用于提高石油采收率[10]。然而，脂肽的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物合成效率低，提高脂肽產(chǎn)量的研究正在起步[11-13]。

結(jié)合糖脂和脂肽的性能優(yōu)勢，從菌株選育出發(fā)，獲得了產(chǎn)生混合型生物表面活性劑的新菌株，并通過培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，提高了發(fā)酵產(chǎn)量，為脂肽-糖脂混合型生物表面活性劑開發(fā)和三次采油等重要應(yīng)用提供了新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及溶血圈法篩選菌株

富集培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)基和溶血圈法篩選菌株參見文獻[14]；其中初始培養(yǎng)基改用蔗糖為碳源，17 g/L NaNO3為無機氮源。

優(yōu)化培養(yǎng)基 (/L)：紅糖 70 g，酵母膏1.0 g，NaNO325 g，Na2HPO4·12H2O 1.0 g，KH2PO40.333 g，MgSO4·7H2O 0.15 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.006 g，MnSO4·H2O 0.006 g，pH 7.0。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)、產(chǎn)物提取和濃度測定

搖瓶培養(yǎng)在37 ℃、200 r/min搖床上進行。發(fā)酵罐培養(yǎng)采用5 L Biostat B plus發(fā)酵系統(tǒng)。發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心40 min，取上清液。采用酸沉堿溶、甲醇抽提和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備金黃或亮黃色產(chǎn)物粉末[14]。

改進排油圈法粗測產(chǎn)物：在玻璃平板內(nèi)加40 mL去離子水，取200 μL油紅O染色的正十二烷平鋪在水面上，穩(wěn)定后加3 μL待測液，照相測排油圈直徑 D，它和產(chǎn)物干重濃度 C呈線性：C(mg/L)=34.434×D (mm)?349.92 (D 為 10～40 mm)。

脂肽 (表面活性素)通過HPLC-UV法定量測定。采用LC-20AT (Shimadzu, Kyoto, Japan)系統(tǒng)，Intersil ODS-SP (GL Sciences, Kyoto, Japan)色譜柱。流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸=85∶15∶0.1，流速0.8 mL/min，檢測波長205 nm。表面活性素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，含4種同系物。

鼠李糖脂定量分析采用蒽酮比色法。向1 mL樣品中加入4 mL蒽酮試劑 (0.2 g蒽酮溶于100 mL 88%硫酸)，混勻后沸水浴 10 min，再在冷水浴中冷卻20 min，測定OD580。脂肽對糖脂測定無干擾。

1.3 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)質(zhì)譜分析和鑒定

脂肽和糖脂鑒定采用飛行時間質(zhì)譜法(Matrix-Assisted Laser Desorption /Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選和生物表面活性劑質(zhì)譜鑒定

采集油田地下廢水、清華校園餐廳油污地面和荷塘底泥、南海底泥等數(shù)十個土壤樣品，富集培養(yǎng)后采用溶血圈法初篩表面活性劑高產(chǎn)菌株。根據(jù)脂肽和鼠李糖脂表面活性高、穩(wěn)定性好的特性，將不同菌株產(chǎn)物放置70 ℃烘箱5 d，選取排油圈直徑未減小的菌株在初始培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取發(fā)酵產(chǎn)物，用于MALDI-TOF質(zhì)譜分析 (圖1)。其中，質(zhì)荷比 (m/z)656.07為雙鼠李糖脂，1 044.66和1 058.67為表面活性素[15]，即產(chǎn)物為脂肽-糖脂混合型生物表面活性劑。對菌株進行16S rRNA基因序列測定和生理生化鑒定，結(jié)果為 Bacillus subtilis subsp. inaquosorum，命名為THY-7。

圖1 菌株篩選、產(chǎn)物制備和質(zhì)譜鑒定Fig. 1 Bacteria screening, product preparation and MALDI-TOF MS analysis. (A)Colonies with transparent circle on the blood plate. (B)Colonies without transparent circle. (C)Oil-red spreading test of THY-7 broth at 48 h. (D)Dried powder of products. (E)MALDI-TOF MS spectrum of THY-7 products. C10:1/C9:1, fatty acid chain C10 or C9 with an unsaturated bond at unclear position. Rha, the rhamnolipid group. C14/C15: fatty acid chain C14 or C15.

2.2 THY-7培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化

溫度和初始pH值優(yōu)化表明，THY-7的最優(yōu)培養(yǎng)溫度和初始pH分別為37 ℃和pH 7.0?？疾炝?種碳源、各5種有機氮源和無機氮源對細胞生長和產(chǎn)物積累的影響 (圖 2)。紅糖優(yōu)于蔗糖、甘油和葡萄糖，是優(yōu)選的較廉價碳源。酵母膏和玉米漿的效果雖略差于蛋白胨和牛肉膏，但更有工業(yè)價值。因玉米漿中雜質(zhì)較多，本文選用1 g/L酵母膏為有機氮進行后續(xù)研究。無機氮則優(yōu)選硝酸鈉。

圖2 THY-7培養(yǎng)基的碳源和氮源Fig. 2 Carbon and nitrogen sources of THY-7. C: 6 carbon sources; 1?6: sucrose, brown sugar, glucose, glycerol, starch and molasses at 30, 30, 31.5, 32.2, 28.4 and 40 g/L,respectively. Org N: 5 organic nitrogen; 1?5: yeast extract,tryptone, corn steep liquor, beef extract and soybean powder at 1, 1, 3, 1 and 1 g/L, respectively. Inorg N: 5 in-organic nitrogen; 1?5: NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3 and urea at 8.7, 10.87, 6.59, 17 and 4.94 g/L (equal N-element),respectively. Experiments were performed 3 times.

圖3 THY-7培養(yǎng)基的單因子優(yōu)化Fig. 3 Medium optimization of THY-7. C/N: sucrose/yeast extract; Nitrate: NaNO3; Phosphate: KH2PO4/Na2HPO4·12H2O; Mg (II): MgSO4·7H2O; Mn (II):MnSO4·H2O; Fe (II): FeSO4·7H2O; 1?5: for C/N: 30:1,40:1, 50:1, 60:1 and 70:1; for nitrate: 4.25, 8.5, 17.0, 34.0 and 51.0 g/L; for phosphate: 0.1/0.3, 0.333/1.0, 1.0/3.0,2.0/6.0, 3.0/9.0 g/L; for Mg (II): 0, 0.03, 0.15, 0.6, 1.0 g/L;for Mn (II): 0, 0. 67, 6, 20, 60 mg/L; for Fe (II): 0, 0.67, 2,6, 20 mg/L, respectively. Experiments reproduced 3 times.

選擇碳氮比 (紅糖/酵母膏的質(zhì)量濃度)、硝酸鹽、磷酸鹽、鎂、錳和鐵離子濃度 6種因素進行單因子優(yōu)化實驗 (圖 3)，以排油圈直徑最大為指標(biāo)，分別獲得了各因素的優(yōu)選單因子濃度。

進一步設(shè)計了如表 1所示的六因素五水平正交實驗。以排油圈直徑為指標(biāo)，完成了25組不同實驗條件下的產(chǎn)物產(chǎn)量評估。結(jié)果表明，A-V、B-II、C-I、D-II、E-IV和 F-II分別是 6個因素的優(yōu)選水平，其中，C/N和硝酸鈉的極差分別是 61和54，其他成分的極差則均小于20，即C/N和硝酸鈉是產(chǎn)物積累的主要影響因素。最終獲得了如“材料與方法1.1”所示優(yōu)化培養(yǎng)基。

表1 THY-7的L25(56)正交試驗設(shè)計Table 1 L25(56)orthogonal test design for THY-7

2.3 優(yōu)化前后細胞生長和產(chǎn)物積累比較

對THY-7進行優(yōu)化前后的搖瓶平行培養(yǎng)，測定細胞密度和生物表面活性劑產(chǎn)量，結(jié)果如圖4A和4B。培養(yǎng)48 h時，細胞OD600為37.0，產(chǎn)物濃度為2.4 g/L，分別是優(yōu)化前的3.4和3.1倍。顯微觀察細胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)32 h時大量營養(yǎng)細胞已轉(zhuǎn)化為休眠芽胞 (圖4C)，因此產(chǎn)物合成基本終止。為此，在5 L發(fā)酵罐中進行補料分批培養(yǎng)，初始裝液量2 L，10 h和12 h分別補充優(yōu)化培養(yǎng)基60 mL，發(fā)酵過程中提取泡沫收集產(chǎn)物。培養(yǎng)25 h后，泡沫產(chǎn)物濃度達到4.5 g/L，是目前報道的國內(nèi)外較好水平。

2.4 THY-7產(chǎn)物中脂肽與糖脂含量的定量分析

表面活性素標(biāo)準(zhǔn)品以及THY-7產(chǎn)物的HPLC色譜圖如圖5A和5B所示。在200 mg/L THY-7產(chǎn)物中，與標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置相同的 4種表面活性素的總濃度為147.8 mg/L，占74%。蒽酮比色法檢測鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)品及 THY-7產(chǎn)物，結(jié)果如圖 5C和5D所示。在100 mg/L THY-7產(chǎn)物中，測得鼠李糖脂為22.0 mg/L，占22%。

產(chǎn)物性能評價還表明，THY-7脂肽-糖脂混合生物表面活性劑具有良好的界面/表面活性、乳化性能和熱穩(wěn)定性，對油砂原油具有高驅(qū)油效率，優(yōu)于實驗室前期篩選獲得的B. subtilis TU2[15]，有望在次采油等領(lǐng)域獲得實際應(yīng)用。

圖4 搖瓶優(yōu)化前后比較及顯微觀察Fig. 4 Flask comparison before and after optimization and microscope observation. (A)Cells’ optical density at 600 nm (OD600). (B)Biosurfactant concentration (dry weight)at 48 h. (C)Microscopic cell morphology of THY-7 at 32 h after optimization. Bar represents 4 μm.

圖5 表面活性素和鼠李糖脂定量分析Fig. 5 Quantification of surfactin and rhamnolipid. (A)HPLC-UV spectra of surfactin standards (Sigma)in 40, 80,120, 160 and 200 mg/L, corresponding to ①?⑤,respectively. (B)HPLC of THY-7 product with respect to surfactin standard. (C)Anthrone colorimetry of rhamnolipid standards in 100, 80, 60, 40 and 20 mg/L,respectively. (D)Anthrone reaction of blank control (left)and 100 mg/L THY-7 product (right).

3 結(jié)論

通過血平板溶血圈快速篩選、改進排油圈法快速檢測、高溫篩選、產(chǎn)物分子質(zhì)譜鑒定和菌株種屬鑒定，獲得了一株產(chǎn)脂肽-糖脂混合型生物表面活性劑的新菌株，命名為B. subtilis THY-7。對其培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，利用紅糖為廉價碳源，產(chǎn)物主要為表面活性素和鼠李糖脂。搖瓶分批培養(yǎng)時，產(chǎn)量為2.4 g/L。5 L發(fā)酵罐補料分批培養(yǎng)并提取泡沫，產(chǎn)物濃度為4.5 g/L。其中表面活性素約占74%，鼠李糖脂約占22%。實驗表明，THY-7合成的混合型生物表面活性劑的表面活性、乳化和驅(qū)油性能突出?？梢灶A(yù)期，繼續(xù)進行菌株改造以及補料培養(yǎng)耦合產(chǎn)物分離等工藝優(yōu)化，產(chǎn)物產(chǎn)量將進一步提高，應(yīng)用前景廣闊。

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