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      微生物發(fā)酵法生產(chǎn)纖溶酶的研究進(jìn)展

      2013-04-08 11:22:06艾瑞波劉曉蘭鄧永平
      食品與機械 2013年2期
      關(guān)鍵詞:纖溶酶纖溶分子量

      艾瑞波 劉曉蘭,2 鄧永平,2

      AIRui-bo1 LIU Xiao-lan1,2 DENG Yong-ping1,2

      李 琰1,2 何 寧1 王曉杰1,2 袁 欣3

      LI Yan1,2 HE Ning1 WANG Xiao-jie1,2 YUAN Xin3

      (1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.黑龍江省普通高等學(xué)校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006;3.齊齊哈爾市環(huán)境監(jiān)測中心站,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

      (1.College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products,College of Heilongjiang Province,Qiqihar,Heilongjiang 161006,China;3.EnvironmentalMonitoring Center Station of Qiqihar City,Qiqihax,Heilongjiang 161006,China)

      血栓栓塞性疾病主要是由于纖溶系統(tǒng)的異常所引起的[1]。血栓疾病的臨床治療方法主要有外科手術(shù)、抗栓療法、溶栓療法,近年來也探索了一些新型治療手段,如超聲波治療、激素取代治療、基因治療、介入治療、細(xì)胞治療等,與其他治療方法相比,溶栓治療效果好、費用低[2-6]。目前臨床已使用的溶血栓藥物有鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)等,這些藥物具有較好溶栓效果,但是還存在一些副作用[7-10],而且價格昂貴。因此,急需研制出具有更高溶栓特異性、更高溶栓效率、更長半衰期、更小副作用的新型溶血栓藥物。從現(xiàn)有報道來看,對新型溶栓藥物的研究主要從以下兩方面開展:①針對現(xiàn)有的溶栓藥物的弊端對其進(jìn)行修飾;②從生物代謝產(chǎn)物中分離溶栓活性成分,生產(chǎn)新型溶栓藥物[11]。

      纖溶酶指的是能夠溶解構(gòu)成血栓的主要成分纖維蛋白的酶。在生物化學(xué)中,纖維蛋白溶解簡稱為纖溶。在人體血液中,存在著凝血系統(tǒng)和纖維蛋白溶解系統(tǒng),它們各受一系列酶促反應(yīng)的調(diào)節(jié),正常生理狀態(tài)下,這兩個系統(tǒng)保持動態(tài)平衡,既保證血液有潛在可凝固性,又保證血液的流體狀態(tài)。纖溶系統(tǒng)主要由纖溶酶原、纖溶酶原激活劑(t-PA、u-PA)、纖溶酶和纖溶酶原激活物抑制劑(如PAI-1)這4個部分組成。纖溶的生物學(xué)作用之一是去除血管、組織液中過剩的纖維蛋白沉積物,以保持血循環(huán)、組織液管道等的通暢[12]。

      微生物在自然界分布廣泛,生長旺盛,繁殖較快,代謝產(chǎn)物繁多,而且發(fā)酵工業(yè)相對完善發(fā)達(dá),占地面積小,可短期內(nèi)得到大量目的產(chǎn)物,因此,微生物成為新型溶栓藥物研發(fā)的主要來源。文章對已見報道的來源于微生物發(fā)酵的纖溶酶的發(fā)酵方法、純化過程和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行綜述,并就研究中存在的一些需要解決的問題進(jìn)行總結(jié)。

      1 來源于霉菌的纖溶酶

      霉菌是絲狀真菌的總稱,是醬曲中的優(yōu)勢生長菌,在生長代謝過程中能夠分泌多種酶類[13]。目前見報道的霉菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶大都是用豆制品加工下腳料作為主要培養(yǎng)基質(zhì)。筆者所在課題組[14]報道了一種來源于根霉(Rhizopus chinensis)液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的纖溶酶的純化方法,以豆粕水解液和麩皮為培養(yǎng)基主要成分經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶,經(jīng)過純化后測得酶分子量為17.0 kDa左右。后來本課題組[15]又報道從一株脈孢菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中得到了一種纖溶酶,體外溶解血纖維蛋白效果顯著,菌株來源于南方小酒藥,安全性較高,目前這兩項研究成果已經(jīng)獲批了國家發(fā)明專利。研究人員[16]從鐮刀菌培養(yǎng)液中先后應(yīng)用鹽析、離子交換和凝膠過濾色譜純化了一種纖溶酶,分子量為27 kDa,最適作用溫度為50℃,最適作用pH為9。閔偉紅等[17]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中篩選出一株具有產(chǎn)纖溶酶能力的枯青霉,以麩皮和豆粕為主要培養(yǎng)基質(zhì),優(yōu)化固體發(fā)酵條件后獲得纖溶酶活性達(dá)到873.76 U/g。也有研究人員[18]從菊花莖中分離到一株鐮刀菌CPCC480097,經(jīng)液態(tài)發(fā)酵得到纖溶酶Fu-P,分別經(jīng)鹽析、mono Q、Superdex75純化了該纖溶酶。Norifumi Shirasaka等[19]從大米酒曲中篩選到黑曲霉KSK-3,經(jīng)液態(tài)發(fā)酵制得纖溶酶,分別經(jīng)鹽析、超濾、一步離子交換、兩步凝膠過濾色譜純化了該纖溶酶。

      2 大型食藥用真菌來源的纖溶酶

      大型食藥用真菌含有多種生理活性物質(zhì)[20-22],作為重要的保健食品已經(jīng)引起人們的廣泛重視。近年來在大型食藥用真菌代謝產(chǎn)物中又發(fā)現(xiàn)了一些種類的纖溶酶,由于利用大型食藥用真菌生產(chǎn)纖溶酶安全性較高,同時其本身又具有重要的生理保健功能,因此大型食藥用真菌成為篩選溶血栓藥物的新資源。

      早在2005年韓國學(xué)者[23,24]就報道分別從紫丁香蘑(lepista nuda)、密環(huán)菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分別分離到了纖溶酶。Jae-Sung Kim等[25]分別應(yīng)用一步離子交換色譜、兩步凝膠過濾色譜從蛹蟲草發(fā)酵液中分離得到一種分子量為52 kDa的纖溶酶,其純化倍數(shù)和回收率分別為191.8和12.9%。Se-Eun Park[26]利用表面培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)金針菇菌絲體,先后通過沉淀、兩步離子交換色譜、兩步凝膠過濾色譜從培養(yǎng)液中純化了一種纖溶酶,回收率為0.69%,純化倍數(shù)為18.52倍,酶分子量大約為37 kDa,最適作用pH為6.0,最適溫度為30℃。沈明花等[27]利用和Se-Eun Park相似的流程從榆干離褶傘菌絲體中純化一種分子量為50 kDa的溶栓酶,活性回收率為6.5%,最適作用pH為6.0,最適作用溫度為35℃。崔莉等[28]從蛹蟲草菌絲體發(fā)酵液中分離純化出一種分子量為27.3 kDa纖溶酶,最適作用pH和溫度分別為6.0和25℃。作者所在課題組[29]報道了蛹蟲草深層培養(yǎng)產(chǎn)新型纖溶酶的純化,采用硫酸銨鹽析、Sephadex G-25凝膠色譜、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色譜、CM-Sepharose FF弱陽離子交換色譜和Superdex 75凝膠色譜對纖溶酶進(jìn)行分離,最終獲得兩種高純度的酶,其中纖溶酶I比活力達(dá)1 467.44 U/mg,純化倍數(shù)為36.07,回收率為5.79%,纖溶酶Ⅱ比活力達(dá)1 681.58 U/mg,純化倍數(shù)為41.33,回收率為4.00%,相對分子質(zhì)量分別約為28 000和32 000。

      3 細(xì)菌來源的纖溶酶

      細(xì)菌生長旺盛,繁殖迅速,可以大大縮短纖溶酶的生產(chǎn)周期。1987年日本的須見洋行等從日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆中提取出具有溶血栓作用的納豆激酶(NK)[30]。隨后,中國學(xué)者相繼從本國的發(fā)酵食品豆豉中分離到了產(chǎn)纖溶酶的枯草桿菌,豆豉纖溶酶具有良好的抗凝、溶栓作用,體內(nèi)半衰期長,不引起機體內(nèi)出血,而且可通過消化道直接吸收,有望被開發(fā)成為新一代溶栓、防栓藥物[31]。

      Wodeuk Kim 等[32]在枯草桿菌(Bacillus sp.CK-114)的代謝產(chǎn)物中分離得到了一種分子量為28.2 kDa的枯草激酶(CK),最適作用溫度為70℃。顧昌玲等[33]從假蕈狀芽胞桿菌B260發(fā)酵液中純化到一種纖溶酶,測定了該酶的N-端序列,并與其他芽胞桿菌來源的纖溶酶的N端序列進(jìn)行比對,確定同源性較低,但是未深入研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)。王成濤等[34]探討了纖溶酶Subtilisin FS33的制備方法,固態(tài)豆豉抽提液經(jīng)硫酸銨分段鹽析,再經(jīng)DEAE-Sepharose FF、Phenyl Sepharose FF、Sephadex G-50凝膠色譜純化,得到電泳純纖溶酶,純化倍數(shù)和回收率分別為34.6倍和13.0%,分子量為30 kDa。Nack-Shick Choi等[35]從腌漬的鳳尾魚中分離到產(chǎn)纖溶酶的金黃色葡萄球菌,該菌分泌的纖溶酶具有較好的熱穩(wěn)定性,分子量為26 kDa,最適作用溫度和pH為85℃和2.5~3.0。黎艷等[36]以海洋枯草芽孢桿菌FA-7為初發(fā)菌株,經(jīng)UV誘變獲得Y-22菌株,發(fā)酵液的纖溶活力為91 011.3 IU/mL,是出發(fā)菌株的3.05倍。和七一等[37]以糞腸球菌EF608為發(fā)酵菌株,利用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和酵母提取物為主要培養(yǎng)基質(zhì),37℃培養(yǎng)10 h,發(fā)酵液的纖溶活性達(dá)到1 833 IU/mL。Han-Young Cho等[38]報道從Aeromonas sp.JH1發(fā)酵液中分離到分子量為36 kDa的纖溶酶,最適作用溫度和pH分別為40℃和8.0。

      4 放線菌來源的纖溶酶

      放線菌是生產(chǎn)抗生素的優(yōu)勢生物,國內(nèi)外對放線菌產(chǎn)纖溶酶的研究甚少,現(xiàn)有的少量研究僅限于鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)纖溶酶方面,而且均止步于酶學(xué)性質(zhì)研究,未深入研究溶解纖維蛋白的機制和功能。

      早在1996年,法國研究人員[39]從鏈霉菌(Streptomyces sp.)發(fā)酵液中純化到了纖溶酶。隨后,中國和印度的研究人員[40,41]也分別報道從鏈霉菌(Strepcomycesmegasporus)發(fā)酵液中分離到了纖溶酶,并對產(chǎn)酶條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。后來,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)纖溶酶的鏈霉菌。武臨專等[42]對一株產(chǎn)纖溶酶的鏈霉菌C3662進(jìn)行了菌種鑒定并對發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。Ratnakar R等[43,44]研究了嗜溫鏈霉菌產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)條件和部分酶學(xué)性質(zhì),確定該酶在體外37℃條件能溶解血液凝塊,在后續(xù)研究中又以2.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)嗜溫鏈霉菌產(chǎn)纖溶酶,利用HPLC研究纖溶酶降解纖維蛋白的情況,并就體外溶解血凝塊試驗與市售纖溶酶進(jìn)行了比較。張立平等[45]利用纖維蛋白平板法篩選到一株高產(chǎn)纖溶酶的放線菌,但是未對該菌進(jìn)行深入研究。湯祝華等[46]從豆豉中分離到白色鏈霉菌(Streptomyces albus)HS1,對該菌產(chǎn)纖溶酶的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行了深入研究,確定以0.3%大豆粉、8%蔗糖、6.67%生豆?jié){為培養(yǎng)基主要成分,添加少量無機離子;發(fā)酵上清纖溶活性可達(dá)207.92 IU/mL。Ju Xiu-yun等[47]從鏈霉菌XZNUM 00004發(fā)酵液中經(jīng)鹽析、離子交換和兩步凝膠過濾純化了纖溶酶SFE1,分子量 20 kDa。

      5 基因工程菌來源的纖溶酶

      從自然界中篩選高產(chǎn)纖溶酶的微生物是隨機的,有一些研究人員已經(jīng)將研究方向與基因工程相結(jié)合,通過制備產(chǎn)纖溶酶的基因工程菌,定向獲取專一性更高的溶栓藥物。

      焦龍等[48]報道了畢赤酵母工程菌pk53產(chǎn)纖溶酶發(fā)酵條件的優(yōu)化,確定培養(yǎng)基組成為麩皮1.5%,豆粕粉2.0%,KH2PO40.5%,MgSO4·7H2O 0.05%;適宜發(fā)酵條件為接種齡14 h,接種量 1%,添加1.5%甲醇,250 mL三角瓶裝液量30mL,菌體生長pH為5.5,誘導(dǎo)產(chǎn)酶pH為6.0;經(jīng)過培養(yǎng),纖溶酶活力可達(dá)到429.06 U/mL。Younes Ghasemi等[49]將枯草桿菌編碼纖溶酶的基因進(jìn)行了克隆,并研究了在大腸桿菌中表達(dá)該基因的條件。

      6 纖溶酶研究中存在的問題

      目前來看,微生物來源纖溶酶的研究過程中有幾個問題需要解決:①發(fā)酵產(chǎn)酶活力還有進(jìn)一步提高的空間;②在分離純化過程中,色譜分離步驟較多,導(dǎo)致酶的回收率偏低;③大多數(shù)已見報道的纖溶酶的最適作用條件和人體生理條件不一致,因此,在其進(jìn)一步應(yīng)用研究中就會受到限制;④酶的纖溶功能性動物模型試驗研究亟待深入進(jìn)行,已見報道具有纖溶作用的酶活性研究僅限于體外在血纖維蛋白平板中對纖維蛋白(原)的水解作用,纖溶酶的體內(nèi)溶栓報道尚不多見。因此需要進(jìn)一步開展此類酶在體內(nèi)的溶栓作用、抗凝血作用、對血液凝固時間(CT)的影響等研究,進(jìn)而可以開展藥理學(xué)、藥效學(xué)、毒理學(xué)和藥代動力學(xué)等方面研究,為研制出更高溶栓特異性、更高溶栓效率、更長半衰期、更小副作用的新型溶血栓藥物奠定基礎(chǔ)。

      7 結(jié)論

      一些霉菌、細(xì)菌、放線菌和大型真菌經(jīng)發(fā)酵都可以產(chǎn)生纖溶酶,除了NK、CK研究較為深入,其它微生物纖溶酶的研究大多停留在分離純化或酶學(xué)性質(zhì)研究上。微生物來源的纖溶酶,特別是來自可食用微生物的纖溶酶,具有開發(fā)為保健食品原料、預(yù)防血栓用藥和治療血栓用藥的潛力。

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