李長偉，邵昕昕

牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司

根霉纖溶酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

李長偉，邵昕昕

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目的：對(duì)根霉cw-1液體發(fā)酵生產(chǎn)的纖溶酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)初探，為天然溶栓藥物的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。方法和結(jié)果：由SDS-PAGE測(cè)定該根霉纖溶酶為單一組分，相對(duì)分子量為32.5kDa；IEF電泳測(cè)定其等電點(diǎn)為8.3；該纖溶酶是一種糖蛋白，總含糖量為2.2%（w/v）。該纖溶酶可依次降解人血纖維蛋白的α、β和γ鏈。最適作用溫度和pH分別為40oC和7.5；在pH5.8～10范圍內(nèi)，37℃保溫24h，殘余纖溶酶酶活在80%以上。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究的根霉纖溶酶可有效降解人血纖維蛋白，并且在人的正常體溫下具有良好穩(wěn)定性，顯示了良好的溶栓藥物特性。

根霉；纖溶酶；酶學(xué)性質(zhì)；溶栓

血栓性疾病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一，利用溶栓劑治療血栓病的溶栓療法被認(rèn)為是最為有效的方法之一。微生物纖溶酶作為天然來源的溶栓藥物，具有重要的臨床應(yīng)用前景及價(jià)值［1］。本文報(bào)道一種來源于根霉cw-1液體發(fā)酵的纖溶酶，對(duì)該纖溶酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步溶栓藥物的開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1儀器、材料與試劑

HASUC恒溫?fù)u床；根霉纖溶酶純酶由根霉cw-1菌株分離純化制得；血纖維蛋白原、尿激酶、凝血酶購自上海經(jīng)科化學(xué)試劑有限公司，其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2纖溶酶活性測(cè)定

采用血纖維蛋白平板法測(cè)定纖溶酶活力［2］。

1.3根霉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

應(yīng)用SDS-PAGE法測(cè)定脈孢霉纖溶酶相對(duì)分子質(zhì)量。選擇凝膠濃度為12%（w/v）的分離膠，5%（w/v）的濃縮膠，交聯(lián)度為2.6%，進(jìn)行垂直電泳。

1.4根霉纖溶酶等電點(diǎn)測(cè)定

應(yīng)用等電聚焦電泳（IEF）測(cè)定根霉纖溶酶的等電點(diǎn)。凝膠濃度T=7.5%，交聯(lián)度C=3%，40%載體兩性電解質(zhì)，進(jìn)行水平電泳。

1.5糖蛋白定性及定量實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用莫氏（Molish）試驗(yàn)對(duì)根霉纖溶酶進(jìn)行糖蛋白定性實(shí)驗(yàn)；采用蒽酮比色法對(duì)含糖量進(jìn)行定量測(cè)定。

1.6根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白實(shí)驗(yàn)

將2%人血纖維蛋白（溶于pH7.5的50mMTris-HCL緩沖液）200μL與60μL 0.01mg/mL的酶液混勻置于離心管中于37oC分別保溫5min、30min、1h、2h、4h和6h，以人血纖維蛋白作對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.7溫度及pH對(duì)根霉纖溶酶活性的影響

取一定量纖溶酶純酶分別置于不同溫度及pH條件下（圖1所示），測(cè)定相對(duì)酶活，以最高酶活為100%；分別將纖溶酶純酶置于不同溫度及pH條件下，分別放置2h、4h、12h和24h后測(cè)定殘余酶活，以初始酶活為100%。

圖1　根霉纖溶酶最適作用溫度（a）及pH（b）

2　結(jié)果

2.1根霉纖溶酶的分子量及等電點(diǎn)

SDS-PAGE測(cè)定該纖溶酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為32.5kDa；IEF測(cè)定其等電點(diǎn)為8.3。

2.2根霉纖溶酶糖蛋白測(cè)定結(jié)果

莫氏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該纖溶酶液面交界處有紫色環(huán)出現(xiàn)，說明該酶蛋白中有可能有糖存在；進(jìn)一步應(yīng)用蒽酮比色法確定了該蛋白含糖量為2.2%（w/v）。

2.3根霉纖溶酶降解人血纖維蛋白情況

本實(shí)驗(yàn)用SDS-PAGE檢測(cè)該纖溶酶對(duì)人血纖維蛋白的降解規(guī)律，結(jié)果顯示，作用5min后α鏈已經(jīng)完全降解，1h后β鏈完全降解，2h后γ鏈降解完畢，這一降解順序與人纖溶酶降解纖維蛋白各亞基的情況是一致的。

2.4根霉纖溶酶的最適溫度、pH及其穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH7.5條件下，該纖溶酶的最適作用溫度為40oC；在40oC下測(cè)定該酶的最適pH為7.5（圖1所示）。同時(shí)，在pH5.8～10范圍內(nèi)，37oC保溫24h，該纖溶酶殘余酶活在80%以上。

3　討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)根霉cw-1纖溶酶的純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，該酶的最適作用溫度及pH接近人體環(huán)境，并且在人體正常環(huán)境下測(cè)定該酶的穩(wěn)定性良好。另外，該酶對(duì)人血纖維蛋白三個(gè)亞基的降解順序與人纖溶酶一致，可見該根霉纖溶酶在性質(zhì)上具有開發(fā)成溶栓藥物的潛力。

［1］張?chǎng)┦?，劉曉蘭，鄭喜群，等.蛹蟲草無性型深層培養(yǎng)液中纖溶酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2012（12）∶1787-1795.

［2］ASTRUP T，MULLERTZ S.The fibrin plate methed for estimating fibrinolytic activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952（40）∶346-351.