Prohibitin啟動子中膽固醇活性作用位點研究*

董　培，　蔣麗娟，　郭勝杰，　劉卓煒，　李永紅，　堯　凱，　秦自科，　韓　輝，　周芳堅△

(1華南腫瘤學國家重點實驗室,中山大學腫瘤防治中心泌尿外科, 廣東 廣州 510060;2 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院廣東省泌尿外科重點實驗室,廣東 廣州 510120)

隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展,靶向性基因治療已成為前列腺癌治療研究的熱點,而尋找高效特異的啟動子則是基因治療研究的關(guān)鍵。我們的前期研究表明，低膽固醇培養(yǎng)的PC-3前列腺癌細胞中抑制素(prohibitin，PHB)表達升高，從而抑制細胞增殖[1-2]。PHB是高度保守的蛋白質(zhì)，是一類新型的分子伴侶蛋白，廣泛存在于卵巢、乳腺、前列腺等上皮細胞的細胞核上，發(fā)揮負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[3],其具體的分子機制尚未完全闡明。研究表明，PHB通過正向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)和促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK) 信號通路而在調(diào)節(jié)細胞代謝、活化和分化方面發(fā)揮多向性調(diào)控的重要作用[4]。 PI3K/Akt和MAPK通路是調(diào)控固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)、雄激素受體(androgen receptor，AR)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的主要通路，提示PHB能夠調(diào)控SREBP信號通路。本實驗通過構(gòu)建PHB啟動子重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至前列腺癌PC-3細胞，并通過檢測螢光素酶報告基因的表達活性變化，分段切除PHB啟動子上約200 bp膽固醇敏感啟動元件區(qū)域，探討并評價PHB啟動子上的膽固醇活性位點，為進一步將其應(yīng)用于前列腺癌靶向基因治療研究打下基礎(chǔ)。

材　料　和　方　法

1材料

螢光素酶報告基因載體pGL3-Basic 為Promega產(chǎn)品，前列腺癌細胞系PC-3 細胞為中山大學腫瘤防治中心實驗室保存。DNA聚合酶、XhoI 、HindIII和T4 DNA連接酶為New England Biolabs產(chǎn)品，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 為Invitrogen產(chǎn)品，質(zhì)粒純化試劑盒及膠回收試劑盒為Qiagen產(chǎn)品，Luciferase Assay System為Promega產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

2方法

2.1PHB基因啟動子引物的設(shè)計和合成、PCR擴增及鑒定同前所述[2]。

2.2pGL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建用XhoI和HindIII內(nèi)切酶雙酶切PCR合成的PHB-Pro、低密度脂蛋白受體(low-density lipoprotein receptor，LDLR)啟動子LDLR-Pro 和pGL3-Basic 載體，凝膠電泳后從凝膠中提取純化DNA，回收的片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞,在氨芐青霉素抗性平板上篩選重組質(zhì)粒。用SacⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定并送公司DNA測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pPHB-1192和pLDLR-234。

2.3重組質(zhì)粒的活性分析分別將pPHB-1192、pLDLR-234及陰性對照質(zhì)粒pGL3-Basic轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞系PC-3,以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞為未轉(zhuǎn)染對照組，同步進行實驗。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育8 h后，更換細胞培養(yǎng)液，分成脂蛋白缺乏胎牛血清(lipoprotein-deficient fetal bovine serum,LPDS)組和LPDS+膽固醇(cholesterol，CHO)組。LPDS組中加入10% LPDS+ 50 μmol/L 甲羥戊酸鹽(mevalonate) 和50 μmol/L司伐他汀(simvastatin)，LPDS+CHO組中再加入10 μmol/L CHO+1 μmol/ L 25-羥基膽固醇(25-hydroxycholesterol)，繼續(xù)放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。裂解細胞,加入螢光素酶檢測試劑, 化學發(fā)光酶標儀 (Promega)上每孔自動加入100 μL Luciferase Assay Reagent 檢測螢光素酶活性。

2.4PHB啟動子分段引物設(shè)計和合成按照PHB啟動子中固醇調(diào)控元件(sterol regulatory element，SRE)同源位點位置設(shè)計合成正向引物：Trun 1: 5’-GCAACTCGAGTGCACTCCAGCCTGGGCAA-3’(-910/+138);Trun 2: 5’-GCAACTCGAGGAGCCAAAGTTTAACGTGCGTT-3’(-858/+138);Trun 3: 5’-GCAA-CTCGAGCTGAGGACGTTTGCAGACAG-3’(-507/+138);Trun 4: 5’-GCAACTCGAGGGCTCTCCTTGCGGCAGTCTTA-3’(-317/+138);Trun 5: 5’-GCAA-CTCGAGGTAGTTCATCTGCTAAGAGCCG-3’(-153/+138);Trun 6: 5’-GCAACTCGAGAGGAGCTCATGCGCAGTATGTG-3’(-35/+138)(下劃線核苷酸部分為1個XhoI內(nèi)切酶 位點， 前面采取4個堿基進行硫代修飾)。 同時采用PHB啟動子全長的反向引物作為反向引物,5’-GCAAAAGCTTCCTCACAAGTCGGACTCACGC-3' (下劃線核苷酸部分為1個HindIII內(nèi)切酶 位點， 前面采取4個堿基進行硫代修飾)。

2.5點突變引物設(shè)計和合成限制PHB啟動子對膽固醇敏感的作用區(qū)域位于Trun 5和Trun 6之間，檢測發(fā)現(xiàn)在這個區(qū)域的基因同源于SRE 的核苷酸位置位于 5’-GGTTCTAAGC-3’(-117/-108)，見圖1。設(shè)計點突變引物如下：Muta(-118/-108)L: GCA GAA CCA GGG TGA CTC ATA TGA GCA CCC TTC CCA GAA C；Muta(-118/-108)R: GTT CTG GGA AGG GTG CTC ATA TGA GTC ACC CTG GTT CTG C。采用Quick Change Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) 試劑盒，dsDNA 50 ng制備成50 μL反應(yīng)體系，PCR 反應(yīng)條件如下： 95 ℃ 30 s，然后進行18次循環(huán)：95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，68 ℃ 2 min，4 ℃終止反應(yīng)。待PCR反應(yīng)產(chǎn)物冷卻后，加入1 μLDpnⅠ，混合均勻，37 ℃ 孵育1 h。轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌和提取質(zhì)粒DNA，最后轉(zhuǎn)染到PC-3細胞，螢光素酶分析同前。

Figure 1. Putative SRE and point mutation site in prohibitin promoter DNA sequence.

圖1推測的SRE位點和點突變位點

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1PHB啟動子和各分段產(chǎn)物構(gòu)建檢測

瓊脂糖凝膠電泳可見分子量從1 192 bp～179 bp不等的條帶，符合實驗設(shè)計長度，見圖2。DNA測序進一步證實。

Figure 2. PCR results of constructedPHBpromoter(P-1192)and successive promoter truncations.

圖2PCR擴增得到的PHB啟動子和各分段產(chǎn)物的凝膠電泳

2PHBpromoter和各分段產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒檢測

XhoI和HindIII雙酶切后，采用T4連接載體PGL3，轉(zhuǎn)染到PC-3 細胞內(nèi)提取質(zhì)粒產(chǎn)物凝膠電泳，可見分子量從約6 000 bp～3 000 bp不等的條帶，符合實驗設(shè)計，見圖3。DNA測序進一步證實。

Figure 3. PCR results of constructed plasmids ofPHBpromoter(pP-1192) and successive promoter truncations.

圖3PHB啟動子和各分段產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒檢測

3雙酶切檢測PHB啟動子和各分段產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒

采用XhoI和HindIII雙酶切質(zhì)粒產(chǎn)物后凝膠電泳，可見酶切下的PHB啟動子和各分段產(chǎn)物，長度符合PCR構(gòu)建產(chǎn)物，在5 000 bp處可見平行酶切產(chǎn)物，為酶切下的pCL3，見圖4。DNA測序進一步證實。

Figure 4. Double digestion ofPHBpromoter plasmid (pP-1192) and successivePHBpromoter truncated product plasmids.

圖4雙酶切檢測PHB啟動子和各分段產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒

4PHB啟動子各分段產(chǎn)物螢光素酶活性

同轉(zhuǎn)染完整PHB啟動子的PC-3細胞比較，轉(zhuǎn)染pPHB-179的細胞螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)。pPHB-179中LPDS組和LPDS+CHO組螢光素酶活性無顯著差異(P>0.05),見圖5。

Figure 5. Relative luciferase activity ofPHBpromoter and successive promoter truncations. LPDS: lipoprotein-deficient fetal bovine serum; CHO: cholesterol.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLPDS group;#P<0.05vsother plasmids.

圖5PHB啟動子各分段產(chǎn)物的相對螢光素酶活性

5SRE基因位點點突變對螢光素酶活性的影響

點突變位于PHB啟動子上的-117～-108 bp的SRE可能位點后，同pPHB-1192 比較，SREMUT 點突變組螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)。SREMUT中LPDS組和LPDS+CHO組螢光素酶活性無顯著差異(P>0.05)，見圖6。

Figure 6. Relative luciferase activity of pGL3 vector (pGL3), fullPHBpromoter (pPHB-1192) andPHBpromoter with mutation of SRE site(SREMUT).Mean±SD.n=3.*P<0.05vsLPDS group.

圖6pGL3、pPHB-1192和SREMUT的相對螢光素酶活性

討　　論

膽固醇在前列腺癌進展中發(fā)揮重要作用。我們既往研究結(jié)果表明，培養(yǎng)基中膽固醇降低抑制前列腺癌PC-3細胞生長，同時PHB基因表達升高[1-2]，提示PHB可能是前列腺癌細胞的膽固醇敏感活性的細胞周期調(diào)控因子。

SREBP是脂肪生成的重要轉(zhuǎn)錄因子，在去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)發(fā)展過程中，前列腺癌組織內(nèi)SREBP表達升高， SREBP的N端(68 kD)轉(zhuǎn)錄進入細胞核增加，與膽固醇和脂肪酸合成有關(guān)的多種基因啟動子上SRE位點相結(jié)合，激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，合成膽固醇[5]，最終轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に貙?dǎo)致腫瘤進展[6]。SREBP及其靶基因FAS具有代謝活性的致癌基因，在前列腺癌進展中發(fā)揮作用[7]。

近年一項研究表明，SREBP表達升高誘導(dǎo)AR啟動子活化和基因表達并且促進前列腺癌細胞增殖[8]。在乳腺癌細胞、肝癌細胞和巨噬細胞中都發(fā)現(xiàn)了SREBP受PI3K/Akt以及MAPK信號通路調(diào)控[9]，采用MAPK和PI3K信號通路抑制劑能夠下調(diào)SREBP和FAS表達并且抑制脂肪酸合成。在LNCaP及C4-2B前列腺癌細胞中采用MAPK選擇性抑制劑，能夠抑制SREBP、FAS和AR蛋白表達[10],抑制前列腺癌細胞生長，提示在AR陽性表達的前列腺癌細胞中，MAPK通路是調(diào)控SREBP、AR和FAS的主要通路?；谝陨涎芯勘砻?，SREBP通過結(jié)合SRE使膽固醇合成相關(guān)靶基因表達上調(diào)，在CRPC進展過程中發(fā)揮重要作用。

目前研究已經(jīng)證實，PHB基因3′非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)具有阻止細胞G和S期間增殖功能的作用。在正常成纖維細胞和HeLa細胞中顯微注射PHB mRNA能阻止細胞進入S期[11]。在病毒和質(zhì)粒載體中基于PHB mRNA 3′UTR的抑制子RNA的表達能用于治療癌癥，相似的反義抑制靶標編碼序列作用PHB 3′UTR可能會通過降低RNA穩(wěn)定性而降低PHB蛋白表達水平，編碼區(qū)的反義治療可特異地降低蛋白水平并使抑制子RNA 3′UTR整體抑制細胞增殖。對PHB的3′UTR與α-原肌球蛋白和核苷酸還原酶關(guān)系的研究表明，PHB3′UTR片段代表著一類獨特的RNA調(diào)節(jié)因子，對控制增殖、分化和抑制腫瘤有重要作用[22]。

我們的前期研究和本研究均證實，低膽固醇培養(yǎng)基中前列腺癌PC-3細胞中的PHB表達顯著高于對照組。 本研究進一步通過系列的PHB基因啟動子分段切除并結(jié)合pGL3載體，轉(zhuǎn)染至PC-3細胞進行螢光素酶活性測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對膽固醇敏感區(qū)域位于PHB啟動子3′UTR上的-153～-35 bp區(qū)間,這同其它研究認為PHB 3′UTR為其發(fā)揮作用位點的結(jié)論一致。此后通過序列分析證實在PHB啟動子-117 bp～-108 bp存在SRE同源位點(5’-GGTTCTAAGC-3’)，點突變此位點導(dǎo)致螢光素酶活性顯著下降。以上證據(jù)表明，此SRE同源位點是PHB發(fā)揮其膽固醇敏感活性的作用位點。SRE是SREBP通路合成膽固醇中的重要調(diào)控基因，同時提示了PHB同SREBP可能存在聯(lián)系。在前列腺癌CRPC進展過程中，SREBP表達上調(diào)合成膽固醇最終轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に?。這也是目前采用雄激素阻斷的內(nèi)分泌治療失敗的重要機制之一。進一步研究膽固醇敏感PHB在前列腺癌CRPC進展中的作用，不僅能深入闡述CRPC進展機制，并且為臨床提供新的靶向治療理論依據(jù)及新的預(yù)后指標。

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