系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者樹突狀細胞對Th1/Th2細胞分化的影響

周紅娟 施華萍 蔡龍 鄭紅霞 馬紀林 陶筱娟

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者樹突狀細胞對Th1/Th2細胞分化的影響

周紅娟 施華萍 蔡龍 鄭紅霞 馬紀林 陶筱娟

目的 探討系統(tǒng)性紅斑狼狼瘡（SLE）患者樹突狀細胞對Th1/Th2細胞亞群分化的影響。方法淋巴細胞分離液分離獲得SLE患者外周血單個核細胞,免疫磁珠陽性分選CD14細胞,聯(lián)合應用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α誘導分化樹突狀細胞成熟。在培養(yǎng)的第9天，流式細胞術(shù)檢測表型,細胞增殖/毒性劑盒分析樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-12和IL-10的表達。誘導的成熟樹突狀細胞與健康對照組淋巴細胞共培養(yǎng)5d后，佛波酯+離子霉素+莫能霉素刺激培養(yǎng)4h，進行T淋巴細胞表面抗原及胞質(zhì)內(nèi)細胞因子染色，流式細胞儀檢測Th1、Th2的比例。結(jié)果SLE患者誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞其CD1a的表達降低（P＜0.05），HLA-DR、CD80、CD86的表達均明顯升高（P＜0.05）。活動組與非活動組的樹突狀細胞HLA-DR、CD80、CD86的表達有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。SLE患者誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力增強（P＜0.05）?；顒咏M與非活動組的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞也有所差異（P＜0.05）。SLE患者誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞分泌IL-12的水平均明顯降低（P＜0.05）；分泌IL-10的水平明顯升高（P＜0.01），活動組與非活動組的樹突狀細胞分泌IL-12和IL-10的水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?；顒咏M的樹突狀細胞與對照組淋巴細胞共培養(yǎng)后Th1的比例明顯降低（P＜0.01），Th2的比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論SLE患者誘導的樹突狀細胞表型增加，刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力增強，分泌IL-12降低，IL-10升高。SLE患者樹突狀細胞功能的異?？赡軐е铝薚h1細胞分化不足，在SLE發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 樹突狀細胞 Th1/Th2

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect o f dendritic cells(DC)on Th1/Th2differentiation in patients with systemic lupus erythematosus(SLE).MethodsPeripheral blood mononuclear cells(PBMC)were isolated and purified by a high gradient magnetic cell sorting system(MACS).GM-CSF,IL-4 and TNF-α were used to induce matured DCs,the phenotype of DCs was analyzed by immunofluorescence staining and flow cytometry 9d after induction.The ability of inducing proliferation of allogenic lymphocytes was examined by cell counting Kit-8(CCK-8).The production of IL-12 and IL-10 by the induced mature DCs were measured by ELISA.The lymphocytes in PBMC were separated by the adherent method,and were co-cultured with the matured DC from SLE patients.After 5 days,CD4+T cells were stimulated with PMA+ionomycin+monensin and the differentiation of Th1/Th2cells was detected by flow cytometry using intracellular fluorescent staining of IFN-γ and IL-4.ResultsThe expresses of CD80,CD86 and HLA-DR in DCs from SLE patients were increased(P＜0.05),that of CD1a was decreased(P＜0.05).There were significant differences in expression of HLA-DR,CD80,CD86 and ability of inducing allogenic lymphocytes proliferation between active and inactive cases(P＜0.05).The levels of IL-12 were reduced and IL-10 increased significantly in the induced mature DCs from SLE patients.There was no significant difference between active and inactive cases.In comparison to health controls, the percentage of Th1cells in CD4+T was lower when co-cultured with the matured DC from SLE patients.ConclusionThe results indicate that Th1cell differentiation is impaired in patients with SLE,which may be associated with the dysfunctions of dendritic cells.

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）免疫紊亂表現(xiàn)在T、B細胞高度活化增生，大量自身抗體產(chǎn)生，最終形成免疫復合物沉積于組織中，Th1/Th2細胞比例失調(diào)，細胞因子異常等[1]。但最根本的環(huán)節(jié)是機體對自身抗原的耐受遭到破壞，或機體免疫系統(tǒng)過度遞呈自身抗原，致使初始型T細胞發(fā)展為反應性T細胞，導致自身免疫性疾病的發(fā)生。樹突狀細胞被認為是目前所知功能最強的專職抗原遞呈細胞，能選擇性誘導Th0向Th1或Th2分化，從而調(diào)控T淋巴細胞免疫應答的類型[2]。本研究通過觀察SLE患者外周血中的樹突狀細胞的表型、功能以及對Th1/ Th2分化的影響，對兩者之間的關(guān)系進行初步探討，為SLE的免疫治療提供方法和策略。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2011-01—2011-12我院風濕免疫腎病科門診和住院的SLE患者20例，均符合1997美國風濕病學會制定的SLE診斷標準。以SLE疾病活動指數(shù)（SLEDAI）積分來判斷疾病活動程度。其中男2例，女18例，年齡15～49（33±9）歲；按SLEDAI≥6分為界限，將SLE患者分為活動組和非活動組，兩組SLEDAI積分（9.0±2.9、3.2±1.8）差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。選擇我院體檢的性別、年齡相匹配的健康志愿者10例為對照組，其中男1例，女9例，年齡19～45（34±13）歲。本研究遵循倫理學標準，并得到本院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 RPMI 1640，胎牛血清（FBS）為美國GIBICO公司產(chǎn)品；Ficoll400為美國USBiological公司產(chǎn)品；CD14磁珠分選試劑盒（人）為德國Miltenyibiotec公司產(chǎn)品；重組細胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α購自美國 PeproTech公司；PE標記的 CD83、CD86、HLA-DR和FITC標記的CD14、CD1a、CD80及同型對照，IL-12、IL-10 ELISA試劑盒，功能級純化的抗CD3和抗CD28購于美國Ebioscience公司；CCK-8試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PE-Cy5標記的CD3、PE-TR標記的CD8、FITC標記的IFN-γ、R-PE標記的IL-4和FIX&PERM破膜劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。流式細胞儀為Beckman coulter公司產(chǎn)品，型號為EPICS-XL。

1.3 方法

1.3.1 CD14+單核細胞收集及樹突狀細胞的體外誘導抽取SLE患者、健康志愿者靜脈血20ml，肝素抗凝，用Ficoll淋巴細胞分離液提取PBMC，按CD14磁珠分選試劑盒說明書分選CD14細胞。分選后流式分析CD14細胞的純度，結(jié)果顯示其達到90%左右。

將各組CD14+細胞按1×106/ml接種于24孔板，每孔用1ml含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加誘導因子rhGM-GSF（1 000U/ml）、rhIL-4（500U/ml），5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)。第3天半量換液。6d后更換等量的含有rhTNF-α（1 000U/ml）的完全培養(yǎng)基，3d后可獲得成熟的樹突狀細胞。

1.3.2 樹突狀細胞表型的檢測 收集誘導培養(yǎng)的SLE患者、對照組的樹突狀細胞，分別計數(shù)2×105個細胞置流式管中，分別加入PE或FITC標記的抗人CD1a、CD83、CD80、CD86、HLA-DR單克隆抗體,常溫下染色20 min，洗滌，500 μl PBS重懸，上流式細胞儀測定細胞表面CD1a、CD80、CD86、CD83及HLA-DR的表達水平。

1.3.3 淋巴細胞增殖情況的測定 晨起抽取健康志愿者靜脈血10ml，肝素抗凝，用Ficoll淋巴細胞分離液提取PBMC，細胞貼壁法獲取淋巴細胞作為效應細胞，按2×105/孔接種于96孔板，將1.3.1收獲的成熟樹突狀細胞作為刺激細胞，按照樹突狀細胞∶淋巴細胞為1∶10，1∶20，1∶50，1∶100這4種比例接種，同時設置調(diào)零孔（只加完全培養(yǎng)基）和陰性對照（不加樹突狀細胞），每組設定3復孔。共同培養(yǎng)72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，上酶標儀檢測,在波長490 nm處測定各孔的光密度值（OD值）,以空白孔調(diào)零。計算刺激指數(shù)（SI）表示增殖情況:SI=實驗孔OD490/陰性對照孔OD490。

1.3.4 培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的檢測 收集第9天樹突狀細胞培養(yǎng)上清液，按ELISA Kit操作步驟檢測各組樹突狀細胞培養(yǎng)上清液中IL-12、IL-10的水平。

1.3.5 樹突狀細胞對Th1、Th2分化影響的檢測 收集1.3.3剩余的健康對照組淋巴細胞，計數(shù)待用。將1.3.1誘導的成熟樹突狀細胞以1∶1與健康對照組淋巴細胞混合，每孔細胞總數(shù)為1×106/ml細胞（同時設置空白對照組，不加成熟的樹突狀細胞細胞）加入到預先包被功能級的抗CD3（10μg/ml）的24孔板中，同時加入功能級的抗CD28 2μg/ml，TGF-β15ng/ml的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)5d。若誘導為Th1細胞，培養(yǎng)基中加入IFN-γ（10μg/ml），若誘導為Th2細胞，培養(yǎng)基中加入IL-4（10μg/ml）。

細胞共培養(yǎng)5d后，每孔加入無血清的RPMI 1640液1ml（含PMA 1μg/ml+離子霉素50μg/ml），進行刺激培養(yǎng)，并加莫能霉素（0.1mg/ml）。培養(yǎng)4h后進行T淋巴細胞表面抗原及胞質(zhì)內(nèi)細胞因子染色的檢測：加入20μl CD3-TC和20μl CD8-PE-TR，避光孵育15min。每管中加入100μl Fix&Perm中的試劑A（即固定液），避光孵育15min。PBS洗滌后，分成2管，每管中加入100μl Fix&Perm中的試劑B（即破膜和溶血液），同時加入相應的抗體各10μl：IFN-γ-FITC+IL-4-PE，室溫避光孵育15min，同時設立同型對照管。PBS洗滌后，500μl PBS重懸細胞，上機檢測。以CD3+設門，分析CD8-IFN-γ+和CD8-IL-4+細胞所占的比例，CD3+CD8-IFN-γ+為Th1細胞，CD3+CD8-IL-4+為Th2細胞。以CD3+細胞設門，分析CD69+細胞占CD3+細胞的百分率。要求激活對照陽性率與胞內(nèi)染色對照陽性率均＞95%。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組樹突狀細胞的表型 在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)24h后大部分細胞仍貼壁生長并成簇排列，呈圓形，細胞膜光滑無突起。培養(yǎng)72h后，細胞的形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，懸浮細胞逐漸增多，細胞伸出突起。培養(yǎng)6d后，胞體較大，可見大量細胞集落形成，較多細胞呈半懸浮生長，部分細胞表面出現(xiàn)長短不一的毛刺樣突起，并可見少量單個懸浮的典型樹突狀細胞。培養(yǎng)9 d后，胞體明顯變大，絕大部分細胞呈半懸浮生長，可見胞膜向外伸出樹枝樣突起，呈現(xiàn)典型的樹突狀細胞形態(tài)。

SLE患者活動組樹突狀細胞表達的CD1a水平低于健康對照組（P＜0.05），而CD80、CD86、HLA-DR的表達水平均升高（均P＜0.05）；非活動組CD1a、CD80、CD86和HLA-DR的表達水平與健康對照組差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。各組樹突狀細胞的CD83表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組樹突狀細胞表型檢測結(jié)果（%）

2.2 各組淋巴細胞的增殖情況比較 與健康對照組相比，SLE患者誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力增強（P＜0.05）?；顒咏M與非活動組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而非活動組與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

2.3 各組培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的比較 與健康對照組比較，SLE患者（活動組、非活動組）培養(yǎng)的樹突狀細胞分泌IL-12的水平均降低（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.01），而活動組與非活動組誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞分泌IL-12、IL-10的水平差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。詳見表3。

表2 各組淋巴細胞增殖能力（SI）的比較

表3 各組培養(yǎng)上清液中IL-12和IL-10水平的比較（pg/ml）

2.4 各組樹突狀細胞對Th1、Th2分化影響的比較 見表4、圖1。

表4 各組樹突狀細胞對Th1、Th2分化影響的比較（%）

由表4、圖1可見，與對照組比較，SLE活動組的樹突狀細胞與健康對照組淋巴細胞共培養(yǎng)后Th1的比例明顯降低（P＜0.01），Th2比例差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

SLE是一種常見的自身免疫性疾病，其主要特點是自發(fā)性的T細胞激活以及Th細胞輔助的B細胞多克隆激活，導致大量自身抗體產(chǎn)生，核小體形成，循環(huán)免疫復合物增多。目前對于SLE自身免疫異常的機制不十分清楚，可能涉及3個環(huán)節(jié)：（1）自身抗原激活;（2）抗原遞呈細胞;（3）增強共刺激信號[3]。

SLE患者的發(fā)生、發(fā)展均與樹突狀細胞的改變有著密切的關(guān)系[4]。本研究中分離SLE患者外周血CD14單核細胞，聯(lián)合應用GM-CSF和IL-4選擇性促進樹突狀細胞優(yōu)勢增生，并以TNF-α促進樹突狀細胞進入成熟階段。成熟的樹突狀細胞高表達MHC-Ⅱ、CD40、CD80、CD83、CD86等免疫分子。本研究中，SLE外周血單核細胞誘導的樹突狀細胞各表型表達百分率較對照組有所提高，除CD80外，均有統(tǒng)計學意義，SLE活動組樹突狀細胞各表型表達較非活動期明顯升高。SLE患者活動組的樹突狀細胞CD1a表達降低，提示可能存在分化障礙。已有報道，SLE患者中循環(huán)樹突狀細胞的總數(shù)比正常對照組低[2]。特別是漿細胞來源的樹突狀細胞（pDC）數(shù)量明顯降低,而且活動期患者循環(huán)樹突狀細胞的數(shù)量明顯低于靜止期患者。T細胞的激活一是需要T細胞表面受體（TCR）與相應的MHC抗原多肽結(jié)合，二是T細胞表面共同刺激受體與共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）相結(jié)合，只有當抗原遞呈細胞傳遞的共同刺激信號存在的情況下，T、B細胞才會出現(xiàn)增生、活化。在SLE患者，即使是在疾病的非活動期也可觀察到CD80和CD86的增高，說明共刺激分子B7與SLE患者自身反應性T細胞形成和激活有關(guān)，這些自身反應性T細胞可以大量增生，產(chǎn)生各種自身抗體，導致器官組織的損傷[4]。HLA-DR為MHC-Ⅱ類分子，表達于B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、活化T淋巴細胞、活化NK淋巴細胞和人祖細胞上[5]。SLE患者HLA-DR表達增高也提示著T、B細胞分化增高。CD83是樹突狀細胞成熟的標志，研究結(jié)果表明，誘導培養(yǎng)的SLE患者外周血單核細胞可產(chǎn)生大量成熟的樹突狀細胞，說明樹突狀細胞在SLE抗原遞呈及產(chǎn)生共刺激信號等方面對SLE的發(fā)生、發(fā)展具有促進和加強的作用[8]。在實驗的過程中還發(fā)現(xiàn)SLE患者誘導培養(yǎng)的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力增強?；顒悠谂c非活動期患者誘導的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞也有所差異，而非活動期與健康對照組所誘導的樹突狀細胞刺激同種異體淋巴細胞無明顯差異。

圖1 各組樹突狀細胞對Th1、Th2分化影響的流式細胞儀檢測結(jié)果（以CD3+細胞設門）

在體內(nèi)，樹突狀細胞可以通過分泌的多種細胞因子調(diào)節(jié)T細胞亞群的分化[9-10]。IL-12可誘導Th0向Th1細胞分化，本研究結(jié)果表明，SLE患者無論是活動期還是靜止期，其產(chǎn)生的IL-12均低于對照組。SLE患者誘導的樹突狀細胞與健康對照組淋巴細胞共培養(yǎng)后Th1的比例明顯降低，活動組降低更明顯，而Th2的比例無明顯差異。分析此結(jié)果可能與以下因素有關(guān)：（1）已知IL-12誘導Th1細胞的發(fā)育，當IL-12分泌減少時，Th1細胞的發(fā)育受抑制，Th1細胞產(chǎn)生的細胞因子減少。已有文獻報道SLE患者體內(nèi)的IL-1β、IL-2和IFN-γ的基因表達水平較正常人降低或檢測不到[11-12]，細胞免疫功能降低。（2）IL-12分泌減少，導致Th1細胞及其分泌細胞因子的減少，則對Th2型的細胞因子的抑制作用減弱，導致Th2型細胞因子分泌增多。文獻報道SLE患者體內(nèi)有較高水平的Th2細胞因子基因的表達，包括IL-14、IL-6和IL-10，使得SLE患者體液免疫功能增強，產(chǎn)生自身抗體[13-14]。（3）研究已表明SLE患者體內(nèi)有較高水平的IL-10，它能增強B細胞的活性，使其產(chǎn)生自身抗體[15]，而IL-10是合成IL-12的強力抑制物，因此SLE中高水平的IL-10可降低IL-12的水平。IL-10主要是由Th2細胞分泌，在有些情況下，樹突狀細胞可通過分泌IL-10和TGF-β等細胞因子，誘導B細胞發(fā)生Ig類別轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生IgA類抗體；也可通過分泌以IL-1β為主的細胞因子，促進T、B細胞活化。本研究中也檢測到SLE患者誘導的樹突狀細胞分泌的IL-10明顯增加。

本研究提示SLE患者誘導的樹突狀細胞表型增加，刺激同種異體淋巴細胞增殖能力增強，分泌IL-12降低，IL-10升高，導致了Th1細胞分化不足。阻斷或減少成熟樹突狀細胞的產(chǎn)生，防止樹突狀細胞的浸潤，改善其免疫調(diào)節(jié)功能，維持自身的免疫耐受，減少自身抗原的攝取和遞呈，促進Th1細胞的產(chǎn)生，打破原有的惡性循環(huán)，可達到長期緩解SLE癥狀和治療的目的。

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（本文編輯：馬雯娜）

《浙江醫(yī)學》對圖表的要求

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本刊編輯部

Effect of dendritic cells on Th1/Th2differentiation in patients with systemic lupus erythematosus

Systemiclupus erythematosus Dendritic cells Th1/Th2

2012-03-14）

杭州市科技發(fā)展計劃項目（2008333Q27）

310003 杭州，浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風濕免疫實驗室（周紅娟、施華萍、蔡龍），腎病科（鄭紅霞、馬紀林、陶筱娟）

周紅娟，E-mail：zhouhjlan@hotmail.com