miR-139-3p在胃癌組織中的表達及其對細(xì)胞增殖和凋亡的作用

陳樂高 姚海波 關(guān)天培 葉再元 陶厚權(quán)

●論 著

miR-139-3p在胃癌組織中的表達及其對細(xì)胞增殖和凋亡的作用

陳樂高 姚海波 關(guān)天培 葉再元 陶厚權(quán)

目的 研究miR-139-3p在胃癌組織和癌旁組織中的表達水平及其對AGS和SGC-7901胃癌細(xì)胞株的增殖和凋亡的作用。 方法 采用qRT-PCR檢測38例患者胃癌組織與癌旁組織中miR-139-3p的表達情況，并分析miR-139-3p的表達與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系；利用miR-139-3p抑制劑下調(diào)胃癌細(xì)胞株中miR-139-3p的表達，MTT法檢測對AGS和SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 miR-139-3p在胃癌組織中表達高于癌旁組織（P＜0.01），其表達增高與腫瘤大小和部位相關(guān)（均P＜0.05）；下調(diào)miR-139-3p的表達能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、促進細(xì)胞凋亡（均P＜0.05）。 結(jié)論miR-139-3p在胃癌組織中表達增高，可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

miR-139-3p 胃癌 AGS細(xì)胞 SGC-7901細(xì)胞 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡

miR-139-3p Gastric cancerAGS cellSGC-7901 cellCell proliferation Cell apoptosis

胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，在我國發(fā)病率和病死率都非常高[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA（miR NA），作為一種非編碼的內(nèi)源性RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[2]。已有實驗證明，異常表達的miRNA，如miR-101、miR-199a等在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[3-4]。在前期研究利用microRNA芯片篩選出胃癌中異常表達的miRNA，其中miR-139-3p異常表達增高。本研究采用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測胃癌組織與癌旁組織中miR-139-3p的表達情況；分析其表達量與胃癌臨床病理特性之間的關(guān)系；通過miR-139-3p抑制劑下調(diào)胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901中的miR-139-3p的表達，進一步分析miR-139-3p對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用，為進一步研究其在胃癌中的分子生物學(xué)機制和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集浙江省人民醫(yī)院2011-02—06收治的38例新鮮胃癌手術(shù)切除標(biāo)本及癌旁組織（距腫瘤組織5cm以上）。所有病例均經(jīng)病理確診，且術(shù)前未接受過放化療。其中男26例，女12例，年齡34～86歲，中位年齡57歲。腫瘤組織根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）進行病理分期。

1.2 材料 胃癌細(xì)胞株AGS和SGC-7901購自于上海細(xì)胞庫；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司；One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex TaqTMII定量PCR試劑盒購自TAKARA公司；Anti-hsa-miR-139-3p miScript miRNA Inhibitor試劑（MIN0004552）和 miScript Inhibitor Negative Control試劑（1027271）購自于美國QIAGEN公司；GAVA Nexin V Reagent凋亡試劑盒購自德國Millipore公司。

1.3 胃癌組織及癌旁組織中miR-139-3p的檢測

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 按RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。利用miRNA cDNA Synthesis Kit進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×miRNA Reaction Buffer Mix 10μl，0.1%PBS 2μl，miRNA PrimeScrip RT Enzyme Mix 2μl，Total RNA 1μl RNase Free dH2O 5μl；反應(yīng)條件：37℃60min，85℃5s。

1.3.2 Real-time PCR miR-139-3p的正向特異性引物序列為：GGAGACGCGGCCCTGTTGGAGT，內(nèi)參U6B的正向特異性引物序列為：ACGCAAATTCGTGAAGCGTT；反向引物為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的通用引物。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix 10μl，Rox 0.4μl，正反向引物各0.5μl，模板1 μl，dH2O 7.6μl；反應(yīng)條件：94℃4min，1個循環(huán)；94℃5s，55℃20s，72℃20s，40個循環(huán)；熔解曲線程序：95℃1min，55℃30s，95℃30s，1個循環(huán)。

1.4 胃癌細(xì)胞株中miR-139-3p抑制劑的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期AGS和7901細(xì)胞接種于6孔板中（細(xì)胞濃度2×105個/孔）。按轉(zhuǎn)染試劑盒要求，將miR-139-3p抑制劑Anti-hsa-miR-139-3p miScript miRNA Inhibitor作用于細(xì)胞，作為實驗組；將miScript Inhibitor Negative Control作用于細(xì)胞，作為對照組。轉(zhuǎn)染24h后，利用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果及進行細(xì)胞實驗。

1.5 MTT檢測增殖率 收集上述實驗組和對照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml。將200μl細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。分別在培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入20μl MTT液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后取出培養(yǎng)板。吸凈上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩15min。以630nm為參考波長，570nm為測定波長，用多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200）測定每孔的吸光度（A）。相對增殖率（%）=實驗組（A570nm-A630nm）/對照組（A570nm-A630nm）× 100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測凋亡 取上述實驗組和對照組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，PBS洗滌2次，離心去除PBS，加入200μl凋亡試劑染色，混勻，避光放置30min，再次混勻，吸100μl細(xì)胞混合液至96孔板中，加入100μl培養(yǎng)基后上機檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，計量資料均以表示，配對計量資料采用配對樣本t檢驗；等級資料采用χ2或Fisher確切概率檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-139-3p在胃癌組織中表達增高 胃癌組織中miR-139-3p的相對表達量（1.36×10-4±4.01×10-5），高于癌旁正常組織（7.87×10-5±2.81×10-5）。兩者比較具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-139-3p在胃癌及癌旁組織中表達

2.2 miR-139-3p的表達與臨床病理特征的關(guān)系 miR-139-3p的表達增高與胃癌患者的腫瘤部位、直徑相關(guān)（P＜0.05），而與患者性別、年齡、分化程度、TNM分期等無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

2.3 抑制劑對miR-139-3p表達的影響 qRT-PCR的檢測結(jié)果表明實驗組的miR-139-3p表達量明顯低于對照組（P＜0.05）。提示miR-139-3p抑制劑能夠抑制胃癌細(xì)胞中miR-139-3p的表達，見圖2。

2.4 下調(diào)miR-139-3p對胃癌細(xì)胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果表明，下調(diào)miR-139-3p的表達能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)24、48、72h后，實驗組AGS細(xì)胞相對增殖率分別為95.3%±2.18%、87.5%±2.04%、83.8%± 3.59%（均P＜0.05）；實驗組SGC-7019細(xì)胞相對增殖率分別為92.1%±4.22%、85.3%±1.76%、74.7%±3.39%（均P＜0.05）。提示下調(diào)miR-139-3p對胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，見圖3。

2.5 下調(diào)miR-139-3p的表達對胃癌細(xì)胞凋亡的作用 下調(diào)miR-139-3p的表達后，AGS細(xì)胞的早期凋亡比例從7.03%±1.02%增加到16.83%±2.21%，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），而SGC-7901細(xì)胞的早期凋亡比例增加無統(tǒng)計學(xué)差異（7.60%±2.05%vs 8.13%±0.77%，P＞0.05），見圖4。

表1 miR-139-3p的表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 抑制劑下調(diào)miR-139-3p在胃癌細(xì)胞中的表達

圖3 MTT法檢測下調(diào)miR-139-3p后胃癌細(xì)胞增殖情況

圖4 流式細(xì)胞儀檢測下調(diào)miR-139-3p后胃癌細(xì)胞凋亡情況

3 討論

miRNAs是一類由18～23個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA分子，其本身不編碼蛋白質(zhì)，但是可以通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)（3′-untranslational region，UTR）結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或降解翻譯產(chǎn)物導(dǎo)致靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，從而參與靶基因功能的調(diào)節(jié)。miRNA參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和凋亡等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[5]，miRNA還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。有研究表明，大約50%的人類miRNA基因位于染色體的易碎片段和腫瘤相關(guān)區(qū)域，而腫瘤的發(fā)生常常與這些基因的擴增或丟失密切相關(guān)。miRNA表達失調(diào)的現(xiàn)象普遍存在于肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中，并且不同腫瘤其miRNA表達譜也有很大差異[6-11]。miRNA具有類癌基因或類抑癌基因的功能，類癌基因樣miRNA在腫瘤中表達增高或類抑癌基因樣miRNA的表達降低能下調(diào)抑癌基因的活性，促進腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移或耐藥等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[12]。

近來大量研究表明，胃癌是一種多基因疾病，其發(fā)生、發(fā)展是一個多步驟參與、多種相關(guān)基因失活導(dǎo)致的結(jié)果。miRNA可以作為癌基因或抑癌基因在胃癌中發(fā)揮促癌或抑癌作用。Xia等[13]研究表明，miR-124能夠與SPHK1基因的3′-UTR結(jié)合來抑制該基因表達，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。Zhang等[14]報道，miR-181a能夠促進胃癌細(xì)胞7901增殖、克隆形成、侵襲和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，而且進一步原位雜交和熒光素酶報告基因結(jié)果顯示抑癌基因KLF6的表達被其抑制。Liu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在胃癌組織中高表達，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度和淋巴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，Cox比例風(fēng)險回歸模型提示高表達miR-221可能是胃癌預(yù)后的一個危險因子。Zhang等[16]用實時定量PCR證實miR-21在人胃癌組織及細(xì)胞株中顯著過表達，在人胃癌細(xì)胞株AGS中，miR-21的高表達能顯著增強細(xì)胞增殖和侵襲能力，而敲除miR-21導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加，增殖、侵襲和遷移能力明顯下降，進一步研究證實RECK（一種已知的胃癌抑制基因）是miR-21的靶點，即miRNA先通過下調(diào)RECK，然后導(dǎo)致胃癌發(fā)生。本研究表明miR-139-3p在胃癌組織中表達量高于癌旁組織，且miR-139-3p的表達增高與腫瘤大小、部位相關(guān)，當(dāng)miR-139-3p被下調(diào)后，胃癌細(xì)胞株AGS和SGC-7901的增殖被抑制，且AGS細(xì)胞凋亡比例增加。

miR-139-3p的異常表達在其他惡性腫瘤中也有報道。Schmitz等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-139-3p在惡性腎上腺皮質(zhì)瘤中表達量增加了7.49倍，提示miR-139-3p可作為一個惡性腎上腺皮質(zhì)瘤的診斷因子。Shen等[18]報道發(fā)現(xiàn)，miR-139-3p高表達與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移正相關(guān)，提示其可能參與了結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。然而陽圣等[19]利用miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)胃癌中miR-139-3p表達下調(diào)，這與本實驗結(jié)果相反，可能與實驗的樣本數(shù)量及實驗方法不同有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-139-3p在胃癌組織中表達升高，且與胃癌的腫瘤大小、部位相關(guān)。下調(diào)miR-139-3p可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，促進胃癌細(xì)胞凋亡。推測miR-139-3p可能參與了胃癌發(fā)生、發(fā)展，其具體機制尚需進一步研究。

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2012-09-04）

（本文編輯：胥昀）

國家自然科學(xué)基金（81071991）

325000 溫州醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院 (陳樂高、姚海波、關(guān)天培、葉再元，陳樂高系碩士研究生)；浙江省人民醫(yī)院胃腸外科（葉再元、陶厚權(quán)）

葉再元，E-mail：zaiyuanye@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of miR-139-3p on proliferation and apoptosis in gastric cancer. Methods The expression of miR-139-3p in gastric cancer and pericancerous tissues was examined by Real-time PCR.The correlation between miR-139-3p expression and clinicopathologic features of gastric cancer was analyzed.The cultured gastric cancer AGS and SGC-7901 cells were treated with miR-139-3p Inhibitor;the cell proliferation was detected by MTT assay and apoptosis was analyzed by flow cytometry. Results The expression of miR-139-3p increased in gastric cancer compared with pericancerous tissues(P＜0.05).Expression of miR-139-3p was associated with tumor size（P＜0.05）and location（P＜0.05）. Down-regulation of miR-139-3p inhibited proliferation and promoted apoptosis of gastric cancer AGS and SGC-7901 cells. Conclusion miR-139-3p is up-regulated in gastric cancer,which might be involved in the development of gastric cancer.