陳 曦， 曹 慧， 徐 斐， 李紅梅， 于勁松

(上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

鹽酸克倫特羅(CL)俗稱瘦肉精，為一種β興奮劑、平喘類藥物。然而一些不法分子為提高豬肉中瘦肉含量，將其添加在飼料中，而殘留在禽畜體內(nèi)的鹽酸克倫特羅代謝消除緩慢，會(huì)通過(guò)食物鏈直接危害到人類健康。美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)制定了畜產(chǎn)品中瘦肉精的最高殘留限量，其中，畜肉中的最高殘留限量為0.2 μg/kg［1］。目前用于瘦肉精檢測(cè)的試劑盒大多采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA技術(shù)，但這種方法步驟繁瑣，操作復(fù)雜。而直接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法根據(jù)受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合的原理進(jìn)行檢測(cè)，可提高檢測(cè)效率，節(jié)省檢測(cè)成本。

直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法中所用酶標(biāo)抗原的標(biāo)記酶主要有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酯酶(AP)。堿性磷酸酯酶成本較高，辣根過(guò)氧化物酶是ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記酶。辣根過(guò)氧化物酶具有較易提取、價(jià)格相對(duì)低廉、性質(zhì)穩(wěn)定及與抗原或抗體偶聯(lián)后活性損失小等優(yōu)點(diǎn)。目前，酶標(biāo)記抗原的制備方法主要有偶氮化法［2-3］、戊二醛法［4］、碳二亞胺(EDC)法［5］等。其中偶氮化的反應(yīng)過(guò)程過(guò)于激烈，酶活性損失很大，不能用于酶標(biāo)抗原的合成。本試驗(yàn)選取辣根過(guò)氧化物酶作為抗原標(biāo)記酶，采用EDC法制備酶標(biāo)抗原，并對(duì)酶標(biāo)抗原的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

碳二亞胺(EDC)、琥珀酸亞胺(NHS)，均為上海延長(zhǎng)生物有限公司產(chǎn)品;戊二醛、酪氨酸為國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，為上海東風(fēng)生物科技有限公司產(chǎn)品;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl、Na2CO3、NaHCO3、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉等，均為分析純，為上海高信化工有限公司產(chǎn)品;試驗(yàn)用水為雙蒸去離子水。

1.2 酶標(biāo)抗原的制備

采用EDC法［6-9］制備酶標(biāo)抗原，步驟為:① 鹽酸克倫特羅的重氮化:稱取25 mg鹽酸克倫特羅溶于4 ml預(yù)冷的1 mol/L鹽酸中;逐滴加入0.27 mol/L NaNO2溶液，采用淀粉碘化鉀試紙進(jìn)行檢測(cè)，待其為深紫色時(shí)停止滴加NaNO2溶液;4℃冰浴避光反應(yīng)45 min。②鹽酸克倫特羅的衍生化:稱取15 mg酪氨酸溶于0.5 ml 1 mol/L氫氧化鈉溶液中，用pH 9.6的碳酸鹽緩沖稀釋至2 ml;將步驟①中重氮化的鹽酸克倫特羅緩慢逐滴加入到酪氨酸溶液中，不斷攪拌，同時(shí)用1 mol/LNaOH溶液調(diào)整pH值使其保持在9.0至9.6之間;將反應(yīng)液置于4℃冰箱中緩慢攪拌12 h，之后用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，得到鹽酸克倫特羅的重氮化衍生物。③酶標(biāo)抗原的偶聯(lián):取2 ml鹽酸克倫特羅重氮化衍生物溶液，依次加入14.3 mg碳二亞胺和2.4 mg琥珀酸亞胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h;再加入10 mg辣根過(guò)氧化物酶，將混合反應(yīng)液放入4℃冰箱內(nèi)緩慢攪拌12 h;4℃透析除去游離的碳二亞胺、琥珀酸亞胺、鹽酸克倫特羅及鹽酸克倫特羅重氮化衍生物等小分子;封閉游離的活性基團(tuán)后，采用直接ELISA法對(duì)偶聯(lián)液進(jìn)行鑒定。

1.3 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法鑒定酶標(biāo)抗原與抗鹽酸克倫特羅抗體的親和力

參照文獻(xiàn)［10］的方法，將抗鹽酸克倫特羅抗體用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋后，加入到96微孔板中，每孔100 μl，4 ℃孵育12 h;倒出微孔板內(nèi)液體，每孔加入 250 μl清洗液清洗5次;于微孔板內(nèi)加入3%明膠溶液，每孔150 μl，37℃孵育2 h;將所制備的酶標(biāo)抗原稀釋20倍，分別加入到微孔板中，每孔100 μl，37℃孵育1 h，每個(gè)稀釋度做5個(gè)平行;重復(fù)上述洗滌步驟后，向微孔板內(nèi)加入 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)底物，每孔100 μl，室溫反應(yīng)20 min。加入1 mol/L硫酸終止反應(yīng)，并于450 nm下用酶標(biāo)儀讀數(shù)。

1.4 酶標(biāo)抗原制備條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定影響酶標(biāo)抗原制備的主要因素，并以酶標(biāo)抗原的酶活性大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，以確定最佳的酶標(biāo)抗原制備工藝。

1.5 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照方法1.3中的方法進(jìn)行操作。以鹽酸克倫特羅濃度的對(duì)數(shù)值作為橫坐標(biāo)，抑制率作為縱坐標(biāo)，制作直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鈉用量對(duì)酶標(biāo)抗原酶活性的影響

在酸性條件下，亞硝酸鈉可將鹽酸克倫特羅的伯氨基重氮化。由酶標(biāo)抗原活性隨亞硝酸鈉用量變化的曲線可以看出，隨亞硝酸鈉溶液體積的增加，酶標(biāo)抗原與抗鹽酸克倫特羅抗體的親和力呈上升趨勢(shì)，并在亞硝酸鈉溶液體積為0.8 ml(濃度為0.27 mol/L)時(shí)，重氮化反應(yīng)的效果最好，之后隨著亞硝酸鈉用量的進(jìn)一步增加，其親和力下降。

2.2 鹽酸克倫特羅與酪氨酸(Tyr)摩爾比對(duì)酶標(biāo)抗原酶活力的影響

碳二亞胺偶聯(lián)法通常適用于有羧基的半抗原分子的偶聯(lián)，對(duì)于只含有氨基的半抗原，則需要先與含有羧基的蛋白質(zhì)載體形成中間產(chǎn)物，再與碳二亞胺偶聯(lián)。由酶標(biāo)抗原活力隨鹽酸克倫特羅與酪氨酸摩爾比變化的曲線可以看出，在鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3時(shí)，鹽酸克倫特羅衍生化的效果最好。

2.3 鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比對(duì)酶標(biāo)抗原酶活力的影響

酶標(biāo)抗原活力隨鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比變化的曲線顯示，隨著鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比的增加，OD值顯著增加，即酶標(biāo)抗原的酶活性顯著增加，并在兩者比例為1∶4時(shí)達(dá)最大值。當(dāng)鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺的摩爾比超過(guò)1∶4時(shí)，酶活性沒(méi)有顯著性變化，因此選用兩者摩爾比例為1∶4進(jìn)行偶聯(lián)。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶標(biāo)抗原酶活性的影響

由酶標(biāo)抗原活力隨著反應(yīng)時(shí)間變化的曲線可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酶活性顯著增高，這表明碳二亞胺與鹽酸克倫特羅衍生物的偶聯(lián)效果也越好。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2 h后，酶活性達(dá)到最大值，即偶聯(lián)效果最好。因此選用2 h進(jìn)行碳二亞胺與鹽酸克倫特羅的偶聯(lián)反應(yīng)。

2.5 酶標(biāo)抗原制備條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，固定鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3，辣根過(guò)氧化物酶與碳二亞胺的摩爾比為1∶400，選取亞硝酸鈉用量、鹽酸克倫特羅-酪氨酸與碳二亞胺摩爾比和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。制備酶標(biāo)抗原的較優(yōu)工藝條件為，亞硝酸鈉用量為0.8 ml，鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺摩爾比為1∶4，反應(yīng)時(shí)間為2.5 h，此條件下制備出的酶標(biāo)抗原酶活性為1.487 U/mg。鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺的摩爾比對(duì)酶標(biāo)抗原酶活性的影響在0.05水平上最顯著。

2.6 直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線

繪制鹽酸克倫特羅直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，可以看出在1 ng/ml至10 ng/ml之間，抑制率與濃度呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。最低檢測(cè)限為1 ng/ml。

3 結(jié)論

采用碳二亞胺偶聯(lián)鹽酸克倫特羅半抗原與辣根過(guò)氧化物酶法制備酶標(biāo)抗原，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了最佳制備工藝條件:亞硝酸鈉用量為0.8 ml(濃度為0.27 mol/L)，鹽酸克倫特羅與酪氨酸的摩爾比為1∶3，鹽酸克倫特羅衍生物與碳二亞胺的摩爾比為1∶4，反應(yīng)時(shí)間為2.5 h，辣根過(guò)氧化物酶與碳二亞胺的摩爾比為1∶400，此條件下制備出的酶標(biāo)抗原酶活性為1.487 U/mg。采用此酶標(biāo)抗原進(jìn)行直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，繪制出的競(jìng)爭(zhēng)性抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好，最低檢測(cè)限為1 ng/ml。

［1］SAUER M J，PICKETT R J H，DIXON S N.Distribution and elimination of clenbuterol in tissues and fluids following prolonged oral administration at a growth promoting dose［J］.J Vet Pharmacol Ther，1995，18:81-86.

［2］RODA A，MANETTA A C，PIAZZA F，et al.A rapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol［J］.Talanta，2000，52:311-318.

［3］徐淑坤，朱兆海.流動(dòng)注射分析［M］.北京:北京大學(xué)出版社，1991.

［4］楊正濤，張乃生，史利軍，等.克倫特羅單克隆抗體的制備及與其初步鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，5(5):73-78.

［5］呂會(huì)田，樂(lè)加昌，陳存社.克倫特羅小分子半抗原偶聯(lián)率的測(cè)定方法研究［J］.飼料工業(yè)，2005，26(3):57-59.

［6］MAO S，MAZ A.Mechanization of the Bradford reaction for the spectrophotometric［J］.Biochem，2006，351:155-157.

［7］趙肅清，孫遠(yuǎn)明，樂(lè)學(xué)義，等.農(nóng)藥人工抗原合成的研究進(jìn)展［J］.農(nóng)藥，2005，8(8):337-340.

［8］徐修遠(yuǎn)，滑 靜，胡建民.氯霉素人工抗原的合成及其結(jié)合比的測(cè)定［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2005，2(32):24-25.

［9］朱國(guó)念，吳 剛，吳慧明.有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑毒死蜱人工抗原的合成與鑒定［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(6):657-662.

［10］凌欽婕，向軍儉，唐 勇.氯霉素多克隆抗體的制備及特性分析［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，10(5):505-509.