Snail、E-cadherin和MMP-2在I型子宮內(nèi)膜癌中的表達及臨床意義

潘洪琳 馮振中

Snail、E-cadherin和MMP-2在I型子宮內(nèi)膜癌中的表達及臨床意義

潘洪琳 馮振中

目的探討子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中轉(zhuǎn)錄因子Snail、上皮鈣黏附素（E-cadherin）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達關(guān)系，研究Snail促進子宮內(nèi)膜癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制及臨床意義。方法采用免疫組化方法，結(jié)合組織芯片技術(shù)，檢測58例I型子宮內(nèi)膜癌、17例內(nèi)膜不典型增生、21例正常內(nèi)膜組織中Snail、E-cadherin和MMP-2的表達水平，分析3種蛋白表達之間的相關(guān)性及與臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織中存在Snail和MMP-2蛋白的過度表達以及E-cadherin蛋白的低度表達（P＜0．01）。Snail蛋白表達與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0．05），E-cadherin表達的降低與腫瘤肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0．05），MMP-2蛋白表達與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0．01）。子宮內(nèi)膜樣腺癌組織中Snail和E-cadherin的表達存在負相關(guān)關(guān)系（r=-0．259,P＜0．05），而Snail蛋白與MMP-2的表達呈顯著正相關(guān)（r=0．447,P＜0．01）。結(jié)論 Snail可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin和MMP-2蛋白的異常表達促進子宮內(nèi)膜樣腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移，聯(lián)合檢測Snail、E-cadherin和MMP-2對于判斷子宮內(nèi)膜樣腺癌的惡性潛能和生物學(xué)行為具有重要意義。

子宮內(nèi)膜癌 轉(zhuǎn)錄因子Snail上皮鈣黏附素 基質(zhì)金屬蛋白酶2 組織芯片

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征之一。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指在特定生理或病理條件下，具有極性的上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細胞特性的改變過程，并與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Snail作為EMT現(xiàn)象中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過下調(diào)上皮鈣黏附素（E-cadherin）的表達而降低細胞的黏附力，也可通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達而增加腫瘤細胞的侵襲力[3]，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌組織中Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白表達失調(diào)鮮見報道，故本實驗采用免疫組化方法，結(jié)合組織芯片技術(shù)，初步探討Snail、E-cadherin和MMP-2的表達在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2003-01—2011-01浙江省紹興第二醫(yī)院婦產(chǎn)科經(jīng)診斷性刮宮、宮腔鏡檢查和手術(shù)切除的子宮內(nèi)膜組織石蠟標本96例，其中子宮內(nèi)膜樣腺癌患者58例，子宮內(nèi)膜不典型增生17例（復(fù)雜性不典型增生16例，單純性不典型增生1例），正常子宮內(nèi)膜21例（增生期9例，分泌期12例）。子宮內(nèi)膜樣腺癌患者年齡36～76（56.8±8.6）歲。據(jù)2000年FIGO標準，手術(shù)病理分期為Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期20例。根據(jù)2003年WHO標準，分為高分化27例，中分化23例，低分化8例。肌層浸潤＞50%24例，≤50%34例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者15例，無轉(zhuǎn)移43例。子宮內(nèi)膜不典型增生年齡30～66（51.0±10.2）歲。正常子宮內(nèi)膜者年齡23～52（36.5±8.4）歲。子宮內(nèi)膜樣腺癌患者、子宮內(nèi)膜不典型增生者及正常子宮內(nèi)膜者年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及組織芯片 兔抗人多克隆Snail抗體購自Santa cruz生物公司（工作濃度1∶120），鼠抗人單克隆E-cadherin抗體（工作濃度1∶200）、鼠抗人單克隆MMP-2抗體（工作濃度1∶60）、Elivision Plus試劑盒以及DAB顯色液均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。選擇所需病例存檔蠟塊，光學(xué)顯微鏡下根據(jù)HE切片進行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位并標記，參照文獻手工制備組織芯片[4]。

1.2.2 實驗步驟 應(yīng)用Elivision Plus二步法對Snail、E-cadherin和MMP-2進行免疫組化染色。實驗步驟嚴格按照說明書操作。PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.3 結(jié)果判斷 染色結(jié)果采用雙盲法，由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師獨立閱片、計數(shù)。（1）Snail蛋白主要定位于細胞核，陽性標準[5]：①陽性細胞率≤5%計為0分，6%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，＞75%計為4分；②染色強度：無色計為0分，淺黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。為方便數(shù)據(jù)統(tǒng)計，將Snail標本分為陰性表達組（兩者乘積＜2分）及陽性表達組（兩者乘積≥2分）。（2）E-cadherin蛋白主要定位于細胞膜，染色分級標準[6]：以正常內(nèi)膜組織E-cadherin表達為陽性對照，腫瘤細胞無染色或陽性細胞率≤10%計為0分，低度染色且陽性細胞數(shù)≥10%計為1分，中度染色且陽性細胞數(shù)≥10%計為2分，癌細胞染色和正常組織相同者為強度染色，且陽性細胞數(shù)≥10%計為3分。將0～2分者均定為E-cadherin表達降低，3分者定為E-cadherin表達正常。（3）MMP-2蛋白主要定位于細胞質(zhì)，陽性標準判斷方法同Snail蛋白[5]，統(tǒng)計學(xué)分析將MMP-2標本分為陰性表達組（兩者乘積＜2分）及陽性表達組（兩者乘積≥2分）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，相關(guān)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在不同內(nèi)膜組織中的表達 見表1、圖1。

表1 Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在不同內(nèi)膜組織中的表達（例）

圖1 Snail、E-cadherin和MMP-2在子宮內(nèi)膜組織中的表達[A: Snail在子宮內(nèi)膜樣腺癌中陽性表達；B:E-cadherin在子宮內(nèi)膜樣腺癌中缺失表達；C:E-cadherin在正常內(nèi)膜組織中陽性表達；D: MMP-2在子宮內(nèi)膜樣腺癌中陽性表達（×200）]

由表1可見，Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白在Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中的表達率分別為55.2%（32/58）、25.9%（15/58）、51.7%（30/58），較不典型增生和正常內(nèi)膜組織顯著改變，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 Snail、E-cadherin和MMP-2表達與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理指標的關(guān)系 見表2。

由表2可見，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中Snail的陽性表達與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但與其他臨床病理指標差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。E-cadherin蛋白與肌層浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），MMP-2蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 Snail、E-cadherin和MMP-2表達與子宮內(nèi)膜樣腺癌臨床病理指標的關(guān)系（例）

2.3 子宮內(nèi)膜樣腺癌中Snail、E-cadherin和MMP-2表達的的相關(guān)性 見表3。

表3 子宮內(nèi)膜樣腺癌中Snail、E-cadherin和MMP-2表達的相關(guān)性（例）

3 討論

鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail基因定位于人第20號染色體20q12.3，基因全長5 882bp，包含3個外顯子，編碼含264個氨基酸的蛋白質(zhì)，由一個含有4～6個Cys-His（C2H2）型鋅指結(jié)構(gòu)域的高度保守的羧基末端和一個高度可變的氨基末端構(gòu)成。早期研究認為在胚胎發(fā)育中，Snail基因參與中胚層和神經(jīng)嵴的發(fā)育及形態(tài)形成運動，在誘導(dǎo)細胞移動及組織塑形中起重要作用。最近研究報道，在多種人類惡性腫瘤中Snail存在過度表達，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本組實驗中，Snail蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的陽性表達率為55.2%（32/58），明顯高于不典型增生和正常內(nèi)膜組織，并且隨著手術(shù)病理分期的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，Snail陽性表達也明顯升高，提示Snail參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程，過度表達與腫瘤的惡性程度、侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為關(guān)系密切，這與其他文獻報道一致。Yin等[7]研究報道Snail蛋白在36%的胰腺癌中過度表達，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Snail質(zhì)粒至Panc-1胰腺癌細胞株，并采用不同濃度的化療藥物5-氟尿嘧啶或吉西他濱處理轉(zhuǎn)染Panc-1細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞不僅侵襲能力顯著提高，而且化療耐藥性也明顯增強，裸鼠原位種植結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染腫瘤細胞株的體內(nèi)轉(zhuǎn)移率明顯上升。

E-cadherin是普遍存在于人體各種組織細胞中，通過介導(dǎo)同型細胞連接，在維持正常上皮細胞形態(tài)、細胞極性和組織結(jié)構(gòu)完整性中發(fā)揮重要作用。E-cadherin啟動子區(qū)域存兩個相鄰的E-box結(jié)構(gòu)，內(nèi)含有一致的5′-CAGGTG序列，Snail基因以鋅指區(qū)域識別并結(jié)合E-box序列，直接抑制E-cadherin的表達和功能，從而促進EMT發(fā)生。Yokoyama等[8]構(gòu)建了E-cadherin表達陽性的（HOC719-PE）和表達陰性的（HOC719-NE）的口腔鱗癌細胞克隆，結(jié)果發(fā)現(xiàn) E-cadherin陽性的HOC719-PE形態(tài)呈典型的上皮細胞樣，腫瘤侵襲能力較低，不表達 Snail基因；而 E-cadherin陰性的HOC719-NE細胞形態(tài)呈間質(zhì)成纖維細胞改變，腫瘤侵襲能力明顯升高，強烈表達Snail基因。Yoshida等[9]對95例上皮性卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著良性卵巢上皮到交界性腫瘤到卵巢癌的惡變過程，Snail蛋白的表達逐漸升高，而E-cadherin的表達水平不斷降低和缺失，并且Snail陽性表達患者生存時間明顯減少，Snail是獨立的臨床預(yù)后判斷指標。本實驗結(jié)果也顯示，32例Snail陽性的子宮內(nèi)膜癌標本中，有84.4%（27/32）E-cadherin異常表達，而26例Snail陰性的組織，僅有61.5%（16/26）E-cadherin蛋白異常，隨著Snail表達的升高，E-cadherin蛋白表達明顯降低，兩者的表達呈負性關(guān)系（r=-0.259，P=0.049），且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。結(jié)合上述文獻，我們認為，E-cadherin可能是Snail直接作用的靶基因，在子宮內(nèi)膜癌侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用。

Snail作為EMT過程的中心作用因子，不僅與E-cadherin的異常表達有關(guān)，還可能通過調(diào)節(jié)其他下游靶基因而發(fā)揮作用。MMP-2是一種鋅離子依賴性的蛋白水解酶，能夠降解多種細胞外基質(zhì)和基底膜成分，促進腫瘤細胞突破組織學(xué)屏障，形成鄰近組織的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移。但目前Snail和MMP-2在腫瘤中的作用和功能研究較少，相互關(guān)系尚不明確。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MMP-2的表達從正常內(nèi)膜組織到不典型增生再到子宮內(nèi)膜癌的演變過程中不斷遞增（P＜0.01），在累及盆腔淋巴結(jié)標本中，陽性表達明顯增加，而Snail蛋白在子宮內(nèi)膜癌惡性演變過程中也逐漸遞增，與MMP-2的升高趨勢一致，兩者在子宮內(nèi)膜樣腺癌中呈顯著的正相關(guān)（r= 0.447，P＜0.01）。Jin等[10]采用基因芯片技術(shù)分析反義序列沉默Snail后的卵巢癌細胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2的表達和活性也隨之降低，在體內(nèi)原位種植實驗中，Snail基因沉默組的MMP-2蛋白表達顯著抑制，而腫瘤大小和遠處轉(zhuǎn)移病灶明顯減少。以上結(jié)果說明，Snail可能是MMP-2重要的上游調(diào)控因子，Snail能夠調(diào)節(jié)MMP-2的表達和活性并提高腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，Snail作為EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因素，一方面通過抑制E-cadherin的表達，減少腫瘤細胞間的黏附作用和接觸抑制，另一方面也可以刺激MMP-2的分泌，降解腫瘤周圍基質(zhì)，有利于腫瘤細胞的脫落和侵襲，通過多種途徑、多個環(huán)節(jié)在子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此，聯(lián)合檢測Snail、E-cadherin和MMP-2蛋白的異常表達，有助于子宮內(nèi)膜癌惡性程度及臨床預(yù)后的判斷，以Snail為靶點的治療可能成為子宮內(nèi)膜癌的重要治療手段之一。

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Expression of Snail,E-cadherin and MMP-2 in type I endometrial carcinoma and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Snail,E-cadherin and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)in patients with type I endometrial carcinoma and its clinicopathological significance．MethodsTissue microarray and immunohistochemical staining were performed to evaluate Snail,E-cadherin,and MMP-2 expression in 58 cases of endometrial carcinoma, 17 cases of atypical hyperplasia and 21normal endometrial samples．The correlation between these three markers with clinicopathological features were examined．ResultsThe expression of Snail,E-cadherin and MMP-2 proteins was significantly changed as lesions progressed from normal endometrium through atypical hyperplasia to carcinoma,(P＜0．01)．In addition,increased expression of Snail was tightly associated with FIGO stage and lymph node metastasis．Down-regulated expression of E-cadherin protein showed a significantly correlation with myometrial invasion and lymph node metastasis(P＜0．05)．Similarly, MMP-2 protein also correlated with lymph node metastasis(P＜0．05)．In primary endometrioid adenocarcinoma,there was a significant negative association of Snail with E-cadherin expression(r=-0．259,P=0．049),while the expression of Snail was positively correlated with MMP-2(r=0．447,P＜0．01)．ConclusionSnail and MMP-2 expression is up-regulated and E-cadherin expression down-regulated in endometrial carcinoma,and detection of these three markers may predict the potential malignancy and tumor behavior．

Endometrial cancerSnailE-cadherin MMP-2 Tissue microarray

2012-03-26）

（本文編輯：楊麗）

312000 紹興第二醫(yī)院病理科（潘洪琳）；安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科（馮振中）

潘洪琳，E-mail：phl1008@126.com