阿托伐他汀對COPD大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1及膠原表達的干預作用

王建崗 劉進

阿托伐他汀對COPD大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1及膠原表達的干預作用

王建崗 劉進

目的 觀察慢性阻塞性肺疾?。–OPD）大鼠支氣管肺組織轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和膠原表達的變化特點以及兩者相關的關系，探討阿托伐他汀對支氣管肺組織TGF-β1和膠原表達的干預作用。 方法 將雄性SD大鼠分成3組（健康對照組、COPD模型組和阿托伐他汀干預組），10周后用小動物肺功能儀測定氣道阻力（RL）和動態(tài)順應性（Cdyn）；觀察各組大鼠支氣管肺組織的病理特征；測定支氣管肺組織的膠原表達率和TGF-β1含量。比較各組支氣管肺組織TGF-β1含量，支氣管肺組織中膠原的表達率，以及兩者相關性。 結(jié)果 （1）COPD模型組基本符合人類COPD病理生理變化。外周細支氣管平滑肌層和細胞外基質(zhì)膠原較健康對照組大鼠明顯增多。阿托伐他汀干預組與COPD模型組比較，RL減少（P＜0．01），Cdyn增加（P＜0．01）。（2）COPD模型組TGF-β1蛋白（5．66±0．35）μg·L-1，較阿托伐他汀干預組（3．25±0．69）μg·L-1升高明顯（P＜0．01），健康對照組（1．62±0．46）μg· L-1，與另兩組相比降低明顯（均P＜0．01）。（3）COPD模型組支氣管肺組織膠原表達率為（17．18±5．34）%，較健康對照組[（7．42± 2．97）%]增高（P＜0．01），阿托伐他汀干預組為（11．94±4．03）%，較健康對照組升高（P＜0．05），但較COPD模型組降低（P＜0．01）。（4）各組支氣管肺組織TGF-β1含量與膠原表達率呈顯著正相關（r=0．802，P＜0．01）。 結(jié)論 （1）慢性煙薰和氣道內(nèi)滴入LPS能構建含有氣道重構特征的C0PD大鼠模型。（2）支氣管肺組織膠原沉積增多是COPD氣道重構的重要病理變化。膠原表達率與TGF-β1呈正相關，表明TGF-β1在COPD氣道重構中起重要作用。（3）早期應用阿托伐他汀可明顯抑制氣道TGF-β1的表達，影響COPD大鼠氣道重構的發(fā)生、發(fā)展。

慢性阻塞性肺疾病 轉(zhuǎn)化生長因子-β1 膠原 阿托伐他汀

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of atorvastatin on the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1)and collagen in rat model of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．MethodsMale SD rats were divided into three groups;control group,COPD model group and atorvastatin intervention group．After 10 weeks，airway resistance(RL) and dynamic compliance(Cdyn)was measured;the pathological features of lung tissue of three groups were observed;the expressions of TGF-β1 and collagen content in bronchial and lung tissue were measured．ResultsIn COPD model the peripheral bronchiolar smooth muscle layer and collagen in extracellular matrix increased significantly compared to the healthy control group．In intervention group RL reduced(P＜0．01)and Cdyn increased(P＜0．01)compared to model group．The expressions of TGF-β1 of COPD model group was 5．66±0．35/μg·L-1,which was significantly higher than that in intervention group(3．25± 0．69/μg·L-1,P＜0．01)and healthy control group (1．62±0．46/μg·L-1,P＜0．01)．The expression of collagen of bronchial and pulmonary tissue in COPD group was(17．18±5．34)%,which was higher than that in healthy group (7．42±2．97%,P＜0．01),the expression of collagen of intervention group was(11．94±4．03)%,which was higher than that in healthy group(P＜0．05)and lower than that in COPD group (P＜0．01)．The expression of TGF-β1 was positively correlated with collagen expression in bronchial and pulmonary tissue (r=0．802,P＜0．01)．ConclusionThe increased collagen deposition in bronchial and pulmonary tissue is an important pathological changes of COPD airway remodeling,which is associated with up-regulation of TGF-β1 expression．Early administration of atorvastatin can significantly inhibit TGF-β1 expression and interfere in the development of COPD rat airway remodeling．

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種危害人類健康的常見病，預計到2020年COPD將成為世界上引起死亡的第三大病因[1]。它以氣道慢性炎癥和肺泡結(jié)構破壞為特征，吸煙是其最主要的危險因素。然而，肺泡進行性破壞的確切機制目前尚不清楚，此外，并非所有的吸煙者都發(fā)展為COPD，且戒煙后數(shù)年這種病理過程仍持續(xù)存在[2-3]，其具體原因不明。目前大多數(shù)學者傾向于認同在香煙煙霧慢性刺激下遺傳易感者出現(xiàn)持續(xù)的氣道炎癥導致氣道重構是COPD發(fā)生和發(fā)展的主因。我們通過COPD大鼠模型的制備，觀察大鼠支氣管肺組織中轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1和膠原的表達水平和給予阿托伐他汀干預后的變化，探討COPD氣道重構機制及他汀類藥物在COPD氣道重構的發(fā)病過程中所發(fā)揮的保護性作用。

1 材料和方法

1.1 動物的分組及處理 二級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠25只(浙江省醫(yī)學科學院動物中心提供)，體重（200±20）g，采用隨機數(shù)字表法，分為3組。（1）健康對照組（n=7）：為空白對照。（2）COPD模型組（n=9）：分別于第1、28天在大鼠氣管內(nèi)注入濃度為lg/L的細菌內(nèi)毒素（LPS）溶液200μl（購自美國Sigma公司）1次。余周一～五，在自制薰煙箱中，每天薰大前門牌香煙（每支含焦油23mg，尼古丁1.5mg）2次，每次20支薰30min；周六、日上午薰煙1次，共10周。（3）阿托伐他汀干預組（n=9）：每只大鼠于第15天起每天薰煙前胃管注入阿托伐他?。ㄉ唐访毫⑵胀?，美國輝瑞公司生產(chǎn)，批號1237022）10mg/kg，余處理同COPD模型組。

1.2 動物肺功能的測定[4]上述各組大鼠于第71天，稱取體重，用25%烏拉坦4ml/kg腹腔注射麻醉，自制氣管插管，連接氣道并固定，然后在右前胸第4～5肋間胸腔插管，放入密閉容積描記箱，MedLab生物信號記錄分析系統(tǒng)導出潮氣量、氣道流速、跨肺壓，觀察30s，計算氣道阻力（RI，跨肺壓/氣道流速）、動態(tài)肺順應性（Cdyn，潮氣量/跨肺壓），計算第0.3s用力呼氣容積與用力呼氣容積的百分比（FEV0.3/FVC）。

1.3 病理標本制作及TGF-β1、膠原表達的測定 3組動物均經(jīng)股動脈放血處死。剪開胸腔結(jié)扎右主支氣管，取右下葉部分肺組織留作電鏡標本，2.5%戊二醛固定，1%的鋨酸后固定，常規(guī)脫水，樹脂透入包埋，超薄切片，電鏡觀察；余右肺組織迅速置入液氮速凍，保存在-70℃冰箱。左肺10%的中性甲醛溶液25cmH2O水壓下灌注固定20min，再浸入甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟包埋，作HE染色，Masson三色染色。ELISA試劑盒檢測TGF-β1含量；Masson三色染色法檢測膠原表達率。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，計量資料均以表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni和Tamhane法，相關性檢驗采用Pearson直線相關分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 COPD模型組大鼠漸出現(xiàn)飲食、活動減少，平均體重較正常組減輕，后期可見毛發(fā)干枯、發(fā)黃，呼吸頻率加快，可聽到喘息音；阿托伐他汀干預組癥狀較模型組輕；正常組均未見以上情況出現(xiàn)。

2.2 3組大鼠肺功能比較 見表1。

表1 3組大鼠肺功能比較

由表1可見，造模完成后進行肺功能測定，COPD模型組大鼠FEV0.3/FVC、Cdyn較對照組均明顯降低，RL較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），說明小氣道阻力增加，存在明顯氣流受限、阻塞性肺通氣功能障礙；阿托伐他汀干預組FEV0.3/FVC、Cdyn均較COPD模型組升高，RL較COPD模型組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。

2.3 3組大鼠細支氣管管壁HE染色、Masson染色病理 見圖1、2。

由圖1、2可見，正常對照組可見氣管黏膜纖毛柱狀上皮細胞完整，纖毛排列整齊，氣管及各級支氣管見少量杯狀細胞，僅見少量炎細胞浸潤，氣道結(jié)構未見異常，周圍血管壁未見炎癥細胞浸潤，肺泡大小正常，結(jié)構完整，少量炎細胞浸潤。

COPD模型組氣道黏膜上皮層增厚，杯狀細胞增生，黏膜下腺體增生肥大，支氣管管周大量炎癥細胞浸潤，少量紅細胞滲出，氣道壁增厚，上皮下纖維化，膠原沉積，平滑肌增生和肥大，肌成纖維細胞增殖。氣道發(fā)生不完全阻塞，肺泡擴張，肺泡間隔破壞，肺泡纖維化及上皮細胞增生，結(jié)構發(fā)生顯著改變。阿托伐他汀干預組部分支氣管黏膜上皮細胞輕度變性、少量壞死及脫落，未見杯狀細胞的明顯增多，各級支氣管壁有少量炎性細胞浸潤，未見管腔內(nèi)有黏液栓形成，中層平滑肌稍增厚；未見明顯的肺皰腔擴大及肺大皰的形成。

圖1 3組大鼠細支氣管管壁HE染色病理觀察（A：健康對照組；B：COPD模型組；C：阿托伐他汀干預組；×100）

2.4 支氣管肺組織Masson染色膠原表達率和TGF-β1含量比較 見表2。

表2 支氣管肺組織Masson染色膠原表達率和TGF-β1含量比較

由表2可見，COPD模型組支氣管肺組織膠原表達率較健康對照組增高（P＜0.01），阿托伐他汀干預組較COPD模型組降低（P＜0.01），但仍較健康對照組增高（P＜0.05）；COPD模型組支氣管肺組織TGF-β1含量較健康對照組增高（P＜0.01）；阿托伐他汀干預組為較COPD模型組降低（P＜0.01）；但仍較健康對照組增高（P＜0.05）。

2.5 Masson染色膠原表達率與TGF-β1含量相關性分析 支氣管肺組織Masson染色膠原表達率與TGF-β1蛋白含量呈顯著正相關（r=0.802，P＜0.01）。

3 討論

COPD是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，其患病率和病死率仍居高不下。目前認為氣道炎癥和重構在COPD的發(fā)病過程中起重要作用。本實驗在先前建立的大鼠COPD模型基礎上參考文獻[5]，適當延長煙熏時間。結(jié)果表明，本模型組大鼠支氣管肺組織病理形態(tài)和病理生理符合人類慢性支氣管炎及阻塞性肺氣腫的特點，即氣道阻力增加，順應性下降，外周氣道平滑肌增厚，細胞外基質(zhì)膠原明顯增多。

氣道重構是COPD氣流受限難以逆轉(zhuǎn)的病理變化基礎，它引起的氣道不可逆狹窄和持續(xù)氣道高反應性，是COPD反復急性加重和進展的病理基礎[6]。近些年氣道重構的研究越來越受到人們的關注，在COPD疾病的早期即可發(fā)生氣道重構的改變。氣道重構一旦形成，即很難逆轉(zhuǎn)，因此早期對氣道重構的病理過程進行干預，對COPD的預后具有重要意義。以膠原為主的細胞外基質(zhì)過度沉積是COPD氣道重構的重要病理改變，也是COPD氣流阻塞的重要原因。

細胞外基質(zhì)過度沉積是氣道重構的主要病理改變[7]。膠原是肺細胞外基質(zhì)蛋白的主要成分，分布在肺間質(zhì)支氣管與血管周圍。在急性肺損傷早期已經(jīng)啟動膠原合成[8]。另外，膠原積聚是肺纖維化的一個重要特征，在纖維化晚期以Ⅰ型膠原增多為主，而在早期及活躍階段則表現(xiàn)為Ⅲ型膠原增多[9]。我們通過Masson染色半定量方法測定支氣管肺組織膠原含量，結(jié)果顯示模型組大鼠支氣管肺組織膠原較健康對照組明顯升高，說明COPD存在細胞外基質(zhì)重構的特性。氣道壁膠原增多引起管腔狹窄，氣道阻力增加，并使平滑肌收縮效應成倍增加；肺實質(zhì)膠原增多造成肺氣腫和肺纖維化并存，使氣道和肺的可塑性下降，彈性阻力增加，從而影響肺的通氣和換氣功能，最終導致呼吸衰竭。

TGF-β1是一種多效性細胞因子，誘導纖維細胞增生，膠原纖維及細胞外基質(zhì)合成增多、抑制膠原的降解等參與氣道結(jié)構的重構[10]，是不可逆氣流受限的主要原因。吸煙的COPD患者小氣道TGF-β1蛋白和mRNA的表達明顯升高，且與小氣道的阻塞呈正相關。宋一平等[11]最近研究發(fā)現(xiàn)，在COPD模型小鼠中TGF-β1在支氣管黏膜上皮，肺小動脈內(nèi)皮和肺泡巨噬細胞的表達顯著增加，且TGF-β1的量與支氣管平滑肌厚度，膠原厚度呈正相關。牛瑞超等[12]的研究進一步證實，TGF-β1可以通過Smads信號通路抑制COPD支氣管上皮細胞SLPI的表達和分泌，導致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，形成肺氣腫氣道重構的病理生理變化。

本實驗結(jié)果表明，COPD模型組大鼠TGF-β1在支氣管黏膜上皮、肺小動脈內(nèi)皮和肺泡巨噬細胞的表達顯著增強，且其表達與膠原呈正相關，說明其參與了COPD氣道重構過程。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，是已經(jīng)廣泛應用于臨床的降脂藥物，其多效性備受關注。近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了降脂作用外還有抗炎、抗氧化、改善內(nèi)皮功能、調(diào)節(jié)免疫等作用[13-14]。他汀類藥物能夠抑制多種炎癥因子的表達和降低許多血清炎癥標志物，對炎癥反應過程的各階段都有抑制作用。吳尚潔等[15]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能降低由LPS誘導的肺上皮細胞分泌的炎癥因子前列腺素E2（PGE2）和IL-6的濃度。

本實驗結(jié)果顯示，阿托伐他汀干預組與COPD模型組比較，實驗大鼠氣道阻力明顯降低，肺順應性增加，TGF-β1含量及Masson染色膠原表達率的水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此，阿托伐他汀對COPD的氣道炎癥特別是氣道重構有一定的抑制作用，其可能的機制主要是對各種炎癥細胞和炎癥介質(zhì)的抑制。對IL-1的抑制可直接減少TGF-β1的表達；對IL-6的抑制可直接減輕氣道炎癥反應，減少IL-17分泌，降低Th17細胞水平；對金屬蛋白酶的抑制可減輕氣道炎癥反應和肺泡結(jié)構的破壞，進而緩解COPD的進展。

[1] Mathers C D,Loncar D．Projections of global mortality and burden of disease from 2002 to 2030[J]．PLOS Med,2006,3(11): 34-42．

[2] Ind P W．COPD disease progression and airway inflammation: uncoupled by smoking cessation[J]．Eur Respir J,2005,26(5): 764-766．

[3] XIE Qiangmin,ZENG Linghui，ZHENG Yixiong,et al．Bronchodilating effects of bambuterol on bronchocnstriction in guinea pigs[J]．Acta Pharmacologica Sinica,1999,20(7):651-654．

[4] Rubio M L,Sanchez-cifuentes M V,Ortegam,et al．N-acetylysteine prevents cigarette smoke in-duced small airways alterations in rats[J]．Eur Respir J,2000,15(3):505-511．

[5] Bergeron C,Boulet L P．Structural changes in airway diseases: characteristics,mechanisms,consequences and pharmacologic modulation[J]．Chest,2006,129(4):1068-1087．

[6] 李紅梅,崔德健,馬楠,等．細胞外基質(zhì)重構在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型氣流阻塞中的作用[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志,2002,25(7):403-407．

[7] 高鴻美,焦光宇．脂多糖致大鼠急性肺損傷早期Ⅰ型前膠原羧基端肽及轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志,2007,30(9): 703-704．

[8] 蔡后榮,戴令娟．肺纖維化大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子β1和前膠原基因的表達[J]．中華醫(yī)學雜志,2001,51(4):247-248．

[9] Chua F,Sly P D,Laurent G J．Pediatric lung disease:from proteinases to pulmonary fibrosis[J]．Pediatr Pulmonol,2005,39(5): 392-401．

[10] Takizawa H,Tanaka M,Takami K,et al．Increased expression of transforming growth factor-beta1 in small airway epithelium form tobacco smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]．Am J Pespir Crit Care Med,2001,163: 1476-1483．

[11] 宋一平,崔德健,茅培英,等．生長因子在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型氣道重構中的作用[J]．中華內(nèi)科雜志,2000,39(11):751-754．

[12] 牛瑞超,羅百靈．慢性阻塞性肺疾病大鼠支氣管肺組織分泌性白細胞蛋白酶抑制物表達及轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1的影響[J]．中華結(jié)核和呼吸雜志,2007,30(11):851-856．

[13] Walsh G M．Defective apoptotic cell clearance in asthma and COPD-a new drug target for statins[J]．Trends In Pharmacological Sciences,2008,29(1):6-11．

[14] Ambrosi P,Villani P,Habib G,et al．The statins:new properties [J]．Therapie,2003,58(1):15-21．

[15] 吳尚潔,趙水平．阿托伐他汀對脂多糖誘導的肺上皮細胞分泌PGE2和IL-6的影響[J]．中南大學學報(醫(yī)學版),2004,29(2):192-194．

Intervention of atorvastatin on transforming growth factor-β1 and collagen in COPD rat models

Chronic obstructive pulmonary disease Transforming growth factor-β1 Collagen Atorvastatin

2012-10-11）

（本文編輯：沈昱平）

310009 杭州，浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院感染性疾病科（王建崗為在職研究生，現(xiàn)在杭州市急救中心工作）