彭芳 趙力 王國付 林爽燕

Sirt1在非小細胞肺癌中的表達及臨床病理學(xué)意義

彭芳 趙力 王國付 林爽燕

目的探討非小細胞肺癌組織中Sirt1的表達及其對患者預(yù)后的影響。方法收集264例非小細胞肺癌手術(shù)治療患者的臨床病理資料和術(shù)后生存隨訪資料，通過免疫組化的方法檢測Sirt1的表達，分析其與患者臨床病理指標及預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果Sirt1在非小細胞肺癌組織中明顯高于周圍正常肺組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），并且在腫瘤組織（尤其是鱗狀細胞癌）中Sirt1表達越高，患者預(yù)后越差。而與年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床TNM分期等無明顯關(guān)系（均P＞0．05）。結(jié)論Sirt1在非小細胞肺癌（尤其鱗癌）組織中的表達水平有望成為預(yù)測非小細胞肺癌患者預(yù)后的生物標志物。

非小細胞肺癌 Sirt1 臨床病理因素 預(yù)后

沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sir2）相關(guān)酶1（Sirt1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的去乙?；?。它以許多非組蛋白和組蛋白為底物，與多種細胞生物學(xué)功能如基因轉(zhuǎn)錄沉默、細胞生長周期調(diào)節(jié)、能量代謝、胰島素分泌、血管生成、神經(jīng)保護、病毒感染以及細胞衰老密切相關(guān)。近年來研究顯示，Sirt1在許多人類惡性腫瘤中表達上調(diào)，提示其可能參與了腫瘤的形成及進展過程。Sirt1在腫瘤形成中究竟如何發(fā)揮作用成為研究者關(guān)注的熱點。本研究以免疫組化染色方法，檢測Sirt1在非小細胞肺癌腫瘤組織中的表達情況，分析Sirt1表達與臨床病理學(xué)參數(shù)以及預(yù)后間的關(guān)系，探討Sirt1在非小細胞肺癌發(fā)生、發(fā)展中可能起到的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集浙江醫(yī)院病理科2002-01—2010-12非小細胞肺癌存檔標本264例為觀察組（患者均為首次發(fā)現(xiàn)肺癌，術(shù)前未經(jīng)任何治療）。其中男191例，女73例；年齡35～84（63.3±10.3）歲，其中＞60歲160例，≤60歲104例；腫瘤按WHO肺癌組織分類方法分類，其中鱗癌137例，腺癌127例；高分化62例，中分化124例，低分化78例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移106例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移158例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為100、97、37、30例。在264例非小細胞肺癌中選擇101例，取距腫瘤3cm以上的正常肺組織為對照組。所有標本經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)處理后石蠟包埋。對所有患者進行隨訪，其中失訪46例（17.42%）。

1.2 檢測試劑 兔抗人單克隆抗體Sirt1（克隆號：E104）購自英國abcam公司，EnVision試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中山公司。

1.3 檢測方法 檢測Sirt1采用免疫組化EnVision法。操作步驟依照EnVision試劑盒說明書進行免疫組化染色。石蠟塊常規(guī)制備4μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，滴加一抗后4℃過夜，滴加二抗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，染色中采用PBS代替一抗作為陰性對照，乳腺癌腫瘤組織作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判斷 肺癌的組織學(xué)分類按照2004版WHO肺癌組織學(xué)分類，TNM分期按照國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）2009年第7版分期標準。免疫組化結(jié)果評定：Sirt1在無背景著色情況下以胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒者為陽性表達，陽性評分由2位病理科醫(yī)師讀片并判斷。0分為染色細胞比例為腫瘤組織的0～5%，1分為6%～35%，2分為36%～70%，3分為71%～100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，Sirt1在非小細胞肺癌和正常肺組織中的表達用配對卡方McNemar檢驗法，Sirt1與各臨床病理因素的分析采用χ2檢驗。生存分析的作圖采用Kaplan-Meier生存曲線。影響生存期的相關(guān)因素分析采用Cox多因素回歸分析法。

2 結(jié)果

2.1 Sirt1在非小細胞肺癌和正常肺組織中的表達 對101例非小細胞肺癌組織和正常組織的配對研究結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織和正常組織的Sirt1表達均陽性5例，均陰性39例，腫瘤組陽性而對照組陰性者56例，腫瘤組陰性而對照組陽性者1例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=53.07，P＜0.01）。

2.2 Sirt1在肺癌中表達與肺癌臨床病理特征的關(guān)系 見圖1、2和表1。

圖1 Sirt1在肺癌組織中的表達（EnVision法，×100）

圖2 Sirt1在肺癌組織中的表達（EnVision法，×400）

由圖1、2可見，Sirt1在肺癌組織中呈強陽性表達，陽性著色定位于肺癌組織的細胞核，呈棕黃色。

由表1可見，Sirt1表達在不同的患者年齡、性別、腫瘤組織學(xué)類型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 非小細胞肺癌組織中Sirt1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 Sirt1的表達對非小細胞肺癌患者預(yù)后的影響 Sirt1在肺癌中表達的Kaplan-Meier生存曲線見圖3。

圖3 Sirt1在非小細胞肺癌中表達的Kaplan-Meier生存曲線

由圖3可見，非小細胞肺癌Sirt1陰性組（0分）平均生存時間長于陽性1～3分組（均P＜0.01），而1～3分間生存時間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。表示非小細胞肺癌Sirt1表達陽性預(yù)示預(yù)后較差，而不同的表達強度與預(yù)后無明顯相關(guān)。

2.4 Sirt1在137例肺鱗癌和127例腺癌中表達的Kaplan-Meier生存曲線分別見圖4、5。 t 1

圖4 Sirt1在肺鱗癌中表達的Kaplan-Meier生存曲線

圖5 Sirt1在肺腺癌中表達的Kaplan-Meier生存曲線

由圖4可見，肺鱗狀細胞癌Sirt1陰性組（0分）平均生存時間長于陽性1～3分組（均P＜0.01），而1～3分間生存時間比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。表示肺鱗癌Sirt1表達陽性預(yù)示預(yù)后較差，而不同的表達強度與預(yù)后無明顯相關(guān)。

由圖5可見，肺腺癌Sirt1陰性組（0分）與陽性1～3分組無明顯區(qū)別（均P＞0.05）。表示肺腺癌中Sirt1表達陽性及強度與預(yù)后無明顯相關(guān)。

2.5 影響生存期的相關(guān)因素分析 年齡（χ2=60.858，P＜0.01）、分化程度（χ2=89.499，P＜0.01）、TNM分期T（χ2=438.79，P＜0.01），淋巴結(jié)（χ2=111.339，P＜0.01），Sirt1（χ2=42.067，P＜0.01）是非小細胞肺癌患者長期生存的獨立影響因素。由于年齡、TNM分期、Sirt1的回歸系數(shù)（B）均為正值，而分化程度的回歸系數(shù)為負值，提示年齡增加、低分化、腫瘤原發(fā)灶越大（T）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多（N）、有遠處轉(zhuǎn)移、高Sirt1分級是死亡的危險因素；其中，年齡每增加一個級別，死亡風(fēng)險增加1.018倍；分化程度每降低一個級別，死亡風(fēng)險增加0.759倍；原發(fā)灶大小每增加一個級別，死亡風(fēng)險增加1.701倍；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量每增加一個級別，死亡風(fēng)險增加1.355倍；有遠處轉(zhuǎn)移是無遠處轉(zhuǎn)移的1.264倍；Sirt1每增加一個級別，死亡風(fēng)險增加1.142倍。

3 討論

衰老和腫瘤都是蓄積性細胞損失的結(jié)果，并且都與在損失應(yīng)答中特定基因的調(diào)節(jié)有關(guān)。腫瘤是一種年齡相關(guān)性疾病，腫瘤細胞惡性增殖主要表現(xiàn)在兩個方面：凋亡障礙和增殖失控。Sirt1是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的去乙酰化酶,人Sirt1編碼基因位于染色體10q22.1，約33kb，分子質(zhì)量為60KD。在體內(nèi)通過與不同的非組蛋白和組蛋白相互作用來完成不同的功能，在生長調(diào)節(jié)、應(yīng)激應(yīng)答、腫瘤形成和內(nèi)分泌信號上有著廣泛的生物學(xué)功能，并可以影響與腫瘤細胞凋亡及增殖密切相關(guān)的多種蛋白的活性[1]，使突變的腫瘤細胞逃避凋亡和衰老抑制，導(dǎo)致腫瘤和其它疾病的發(fā)生。已經(jīng)證實Sirt1通過對p53蛋白C末端第283位賴氨酸殘基的去乙?；种苝53作為轉(zhuǎn)錄激活因子的活性，減少P53途徑的細胞凋亡和生長抑制，延長壽命，促進腫瘤發(fā)生[2-3]。其它與Sirt1相互作用的蛋白因子還有很多，如超甲基化癌蛋白HIC1通過與Sirt1形成蛋白復(fù)合物，結(jié)合在Sirt1基因的啟動子上抑制其表達，當HIC1蛋白缺失或失活后，Sirt1表達增強，促進腫瘤發(fā)展。AROS蛋白、E2F1可以增強Sirt1的活性[4]。VDR能選擇性調(diào)節(jié)Sirt1的功能[5]。DBC1負向調(diào)節(jié)Sirt1的功能[6]。這些蛋白能在轉(zhuǎn)錄中、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及修飾等多處水平對Sirt1的表達及活性功能進行調(diào)控。

本研究結(jié)果提示，與癌旁正常組織中Sirt1水平相比，非小細胞肺癌組織中Sirt1表達明顯增強，雖然其表達與各項臨床病理參數(shù)均無明顯相關(guān)性，但Cox多因素回歸分析表明Sirt1陽性程度每增加一個級別，患者死亡風(fēng)險增加1.142倍，Sirt1是非小細胞肺癌患者長期生存的獨立影響因素。

本研究中Sirt1陽性者生存期明顯縮短（P＜0.01），這與Tseng等[7]的報道一致（Sirt1陽性者平均生存時間為25.9個月，而陰性者平均生存時間為43.5個月，P＜0.01）。并且本研究在亞型分析中顯示與預(yù)后的相關(guān)性主要體現(xiàn)在肺鱗癌中，而腺癌沒有明顯關(guān)系，這可能與將腫瘤分鱗癌、腺癌兩組統(tǒng)計后樣本數(shù)偏小所致。雖然Tseng[7]沒有分別統(tǒng)計鱗癌與腺癌與生存期的相關(guān)性，但其研究中也表明肺鱗癌患者Sirt1表達增強更明顯，預(yù)后更差，因而認為Sirt1-p53通路在非小細胞肺癌尤其是肺鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，并且對鱗癌和腺癌的調(diào)節(jié)機制很可能是不同的。我們在后續(xù)試驗中要擴大樣本量，期望得到更多完整數(shù)據(jù)，對生存期進行更科學(xué)的統(tǒng)計。

在既往研究中，Jung-Hynes等[8-9]報道與人類正常前列腺上皮組織相比，前列腺癌的細胞中Sirt1明顯有高表達（8～13倍）。抑制Sirt1可阻止FoxO的活性，可在不影響正常前列腺上皮細胞的前提下抑制前列腺癌的發(fā)展。但相反Powell[10]等的研究卻表明Sirt1可抑制前列腺上皮細胞的增殖活性。Sirt1的缺失可誘導(dǎo)前列腺上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生，表明了Sirt1的抗腫瘤作用。Kabra[11]的報道Sirt1在正常腸黏膜上皮及良性腺瘤中高表達，相反結(jié)腸腺癌腫瘤組織中低表達，同樣表明了Sirt1具有抑制腫瘤生長發(fā)展的作用。從目前的報道看，Sirt1在乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌中呈現(xiàn)高表達，在卵巢癌、膀胱癌中呈現(xiàn)低表達，因此Sirt1到底在腫瘤中起著促進發(fā)生還是抑制發(fā)展，有可能是在不同的惡性腫瘤中有不同的作用機制，并且其表達含量及蛋白活性不同，同時Sirt1的底物眾多，其具體機制還需要人們更深入的研究。

Wang等[12]發(fā)現(xiàn)Sirt1的高表達可能抑制Brca1突變相關(guān)的細胞生長和腫瘤的形成。因此有望利用此來治療Brca1相關(guān)的乳腺癌患者。已有報道抑制Sirt1可以抑制癌細胞的生長并增強放療的抗癌作用[13]。Suzuki等[14]報道Sirt1的激活劑SRT1720可以促進乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移，因此Sirt1有潛力成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的靶向目標。這也與Van等[15]綜述中討論的一致，通過使用化學(xué)藥物或蛋白調(diào)節(jié)對Sirt1的活動加以抑制，可以抑制腫瘤的生長，但還需要對Sirt1在正常及不同腫瘤中的作用機制進一步研究，并需要經(jīng)過臨床試驗的認證。

綜上所述，本研究提示非小細胞肺癌尤其是鱗癌組織中Sirt1的表達水平可能是判斷患者預(yù)后的重要標志物。但調(diào)節(jié)其蛋白水平和活性的分子機制，以及影響非小細胞肺癌預(yù)后的具體機制有待進一步研究。而針對Sirt1的表達及活性進行干預(yù)的相關(guān)藥物，有希望成為預(yù)防和治療癌癥的靶向藥物。

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Expression of Sirt1 in non-small-cell lung cancer and its clinicopathological significance

ObjectiveTo investigate the expression of Sirt1 in non-small-cell lung cancer(NSCLC)and its clinicopathological significance．MethodsThe clinicopathological data of 225 patients with NSCLC admitted in Zhejiang Hospital from 2002 to 2010 were retrospectively reviewed．Immunohistochemistry was used to examine the expression of Sirt1 in specimens of lung cancer and pericancerous tissue．The correlations of Sirt1 expression with clinicopathological features and survival of patients were analyzed．ResultsThe expression of Sirt1 was significantly higher in cancerous tissues than that in adjacent noncancerous tissues．The expression of Sirt1 was significantly correlated with overall survival of patients,particularly in patients with squamous cell carcinoma;however,it was not correlated with the age,gender of patients and the histological classification,differentiation, tumor size,lymph node metastasis,distant metastasis and TNM stage of the cancer．ConclusionSirt1 might be a novel biomarker for prognosis of patients with non-small cell lung cancer．

Non-small cell lung cancer Sirt1 Clinicopathological characteristics Prognosis

2012-08-23）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目（2011KYA024）

310013 浙江醫(yī)院病理科（彭芳、趙力、林爽燕），老年病科（王國付）