血清miR-200c水平對胃癌的診斷價值

林國友 鐘海兵 張雪燕 彭永劍

血清miR-200c水平對胃癌的診斷價值

林國友 鐘海兵 張雪燕 彭永劍

目的探討靜脈血清miR-200c水平對胃癌的診斷價值。方法采用逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR方法檢測50例胃癌患者和50例健康對照者靜脈血清中miR-200c的表達(dá)，統(tǒng)計分析miR-200c與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果胃癌患者中血清miR-200c水平明顯高于健康對照組；ROC曲線分析顯示，miR-200c診斷胃癌的ROC曲線下面積為0．725（95%CI 0．698～0．851）,敏感度和特異度分別為67．5%和78．5%。miR-200c水平與患者年齡、性別、腫瘤大小和TNM分期無關(guān)。結(jié)論血清miR-200c水平可能成為胃癌獨立診斷標(biāo)志物。

胃癌 miR-200c 診斷價值

【 Abstract】 ObjectiveTo evaluate the diagnostic value of serum miR-200c as a tumor biomarker in patients with gastric cancer．MethodsFifty patients with gastric cancer and 50 healthy controls were enrolled in the study．Total RNA was extracted from serum samples for measurement of miR-200c levels using real-time PCR．The relationship between miR-200c levels and clinical characteristics of gastric cancer patients was analyzed．ResultsThe relative abundance of serum miR-200c was significantly higher in gastric cancer group than that in control group(P＜0．05)．The AUC-ROC for diagnosing gastric cancer was 0．725 (95%CI 0．698～0．851),and the sensitivity and specificity was 67．5%and 78．5%separately．The circulating miR-200c level was not correlated with the sex,age,tumor volume and TNM stage．ConclusionThese data suggest that increased miR-200c levels are detected in the blood of gastric cancer patients and circulating miR-200c may be used as biomarker for gastric cancer．

胃癌作為常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列，早期診斷對提高胃癌患者生存率，改善生活質(zhì)量有著極其重要的意義[1]。近年來發(fā)現(xiàn)miRNAs是一群生物體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，具有腫瘤早期診斷標(biāo)志物的價值[2]。miR-200家族包含miR-200a、miR-200b、miR-429、miR-200c和miR-141[3]。我們通過實時熒光定量PCR技術(shù)在胃癌患者血清中檢測miR-200c的表達(dá)，探討miR-200c在胃癌診斷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2010-01—2012-12就診于溫嶺市第四人民醫(yī)院的50例新發(fā)胃癌患者的靜脈血清標(biāo)本（胃癌組），男36例，女14例，年齡36～78（62.76±11.35）歲。所有胃癌患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療及其它針對腫瘤的治療。另收集該院同期50例健康體檢者的靜脈血清標(biāo)本作為健康對照組，男37例，女13例，年齡35～75（63.02±9.97）歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 血清留取及RNA的提取 血液離體2h血清自然析出后2 000r/min離心15min，吸取上層血清保存于-80℃冰箱備用。采用Trizol-LS（美國Invitrogen公司產(chǎn)品）試劑提取血清總RNA，取血清1ml與3ml Trizol-LS充分混勻后，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 miR-200c定量檢測 miR-200c定量檢測采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR方法，以U6為內(nèi)參，引物與探針購自美國Applied biosystems公司。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液1.5μl，100mM dNTP 0.15μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1.0μl，RNase抑制劑0.19μl，逆轉(zhuǎn)錄引物3.0μl，總RNA5.0μl，水補足15μl后，置30℃孵育30min，42℃孵育45min，85℃孵育5min。熒光PCR體系如下：2×PCR緩沖液10μl，20×miR-200c特異引物和熒光探針 1μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1μl，水補足至 20μl，置ABI7500熒光PCR儀上按照95℃5min，95℃15s，60℃45s反應(yīng)40個循環(huán)，采集數(shù)據(jù)分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗；血清miR-200c水平對胃癌的診斷價值采用logistic回歸分析及ROC曲線下面積進(jìn)行評價；血清miR-200c水平與臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清總RNA含量的比較 1ml血清提取的總RNA含量在胃癌組為（41.21±6.15）ng/μl，健康對照組為（39.69±9.84）ng/μl，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 兩組血清miR-200c水平的比較 以U6做內(nèi)參計算血清miR-200c的相對含量，結(jié)果顯示胃癌組血清miR-200c水平明顯高于健康對照組（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組血清miR-200c水平的比較（以U6為內(nèi)參的相對值，*有1個樣本水平超過0.5）

2.3 血清miR-200c水平與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系分析 將血清miR-200c相對表達(dá)水平臨界閾值設(shè)定為0.12（miR-200c相對表達(dá)水平在0.12以上診斷為胃癌），對其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明血清miR-200c水平與患者年齡、性別、腫瘤大小和TNM分期等因素?zé)o關(guān)（表1），說明血清miR-200c水平是胃癌的一個獨立診斷指標(biāo)。

2.4 血清miR-200c水平對胃癌的診斷分析 ROC分析結(jié)果顯示ROC曲線下面積為0.725（95%CI 0.698～0.851），見圖2。根據(jù)ROC分析，將miR-200c相對表達(dá)水平臨界閾值設(shè)定為0.12時，診斷敏感度為67.5%，特異度為78.5%。

3 討論

腫瘤標(biāo)志物是指在惡性腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或由機體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生或升高的反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)，存在于患者的血液、體液、細(xì)胞或組織中，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為此類腫瘤標(biāo)志物可以反映癌細(xì)胞的存在與活躍程度。

表1 血清miR-200c水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（例）

圖2 血清miR-200c水平診斷胃癌的ROC曲線

以往各種紛繁復(fù)雜的腫瘤標(biāo)志物多集中于蛋白質(zhì)水平，而且臨床工作中以及大量的研究結(jié)果顯示以上的腫瘤標(biāo)志物存在一定的局限性[4-6]。miRNA在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化調(diào)控、傷口愈合和免疫系統(tǒng)等。miRNA的表達(dá)譜具有組織特異性，在一些疾病尤其是腫瘤組織中miRNA表達(dá)明顯改變，可用于腫瘤等疾病的診斷和預(yù)后。最近在人血清等體液中檢測到穩(wěn)定性良好的循環(huán)miRNA，在正常人和腫瘤等疾病患者體內(nèi)循環(huán)miRNA的表達(dá)譜存在明顯的差異，因此循環(huán)miRNA很可能成為腫瘤等疾病的非侵入性的、準(zhǔn)確的新型生物標(biāo)志物[7-8]。miRNA標(biāo)志物將成為疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)基因標(biāo)志物、蛋白質(zhì)標(biāo)志物和代謝物標(biāo)志物整體網(wǎng)絡(luò)中的結(jié)點。

本研究通過熒光PCR技術(shù)檢測了miR-200c在胃癌患者血清中的含量，確定了其在胃癌患者中高表達(dá)；而且與年齡、性別等因素?zé)o關(guān)，可能是一個獨立診斷指標(biāo)；隨著研究的深入，在血漿miRNA中可能會發(fā)現(xiàn)更為理想的胃癌標(biāo)志物，從而有助于提高胃癌的診斷水平，改善胃癌的治療效果及預(yù)后。

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Serum miR-200c in diagnosis of gastric cancer

Gastric cancermiR-200c Diagnostic value

2013-01-18）

（本文編輯：沈昱平）

溫嶺市科學(xué)技術(shù)局資助項目(2012-12-95)

317511 溫嶺市第四人民醫(yī)院消化內(nèi)科（林國友、彭永劍）；溫嶺市第一人民醫(yī)院（鐘海兵、張雪燕）

林國友,E-mail：wllinguoyou@163.com