慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血組蛋白去乙?；?的表達(dá)及臨床意義

葉瑞海 張鳴華 慈曉 上官宗校 林海 趙仁國(guó) 許建華

●診治分析

慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者外周血組蛋白去乙酰化酶2的表達(dá)及臨床意義

葉瑞海 張鳴華 慈曉 上官宗校 林海 趙仁國(guó) 許建華

目的探討慢性阻塞性肺疾?。–OPD）急性加重期患者外周血組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 2, HDAC2）的表達(dá)及其與C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣原素（PCT）的關(guān)系。方法選擇67例COPD急性加重期患者，根據(jù)病情分為輕、中、重度3組，均行肺功能檢查。選擇同期體檢中心20例健康體檢者為對(duì)照組。ELISA雙抗體夾心法測(cè)定HDAC2表達(dá)水平，免疫比濁法測(cè)定炎癥蛋白CRP、PCT濃度。結(jié)果隨著病情的加重，外周血炎癥蛋白CRP、PCT濃度顯著升高，而HDAC2濃度呈逐漸下降趨勢(shì)，各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．01）。HDAC2表達(dá)水平和炎癥蛋白PCT濃度呈負(fù)相關(guān)（P＜0．05）。結(jié)論HDAC2可能是COPD急性加重期患者炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。

慢性阻塞性肺疾病 組蛋白去乙?；割?lèi) 降鈣素原 C反應(yīng)蛋白

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，是一種具有氣流受限特征的可防可治疾病，其氣流受限呈不完全可逆、進(jìn)行性發(fā)展，與肺臟對(duì)吸入煙草、煙霧等有害氣體或顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。基因的表達(dá)和染色體的重構(gòu)密切相關(guān)，組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）通過(guò)乙酰化修飾組蛋白分子末端賴(lài)氨酸殘基,使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)解鏈效應(yīng)，基因序列向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物開(kāi)放，啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）能夠抑制基因的表達(dá)[2-3]。大多數(shù)的真核細(xì)胞均可表達(dá)類(lèi)HDAC，但不同的細(xì)胞表達(dá)不同的HDAC。目前認(rèn)為組蛋白脫乙酰基酶2（HDAC2）是一個(gè)重要的參與基因轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的核酶，通過(guò)對(duì)組蛋白乙酰化和去乙?；降碾p向調(diào)節(jié)，增加組蛋白去乙?；?穩(wěn)定染色體結(jié)構(gòu)，阻斷轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合,從而下調(diào)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[4]。筆者通過(guò)測(cè)定COPD急性加重期患者外周血HDAC2的表達(dá)以及C反應(yīng)蛋白（CRP）、降鈣原素（PCT）濃度，探討3者間的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2010-06—2012-04在我院就診的67例COPD急性加重期患者，其中男43例，女24例，年齡42～83歲，平均（68±12）歲。所有患者均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》標(biāo)準(zhǔn)[1]，并根據(jù)嚴(yán)重程度分為3組，輕度COPD組21例，男11例，女10例，年齡46～83歲，平均（64±10）歲；中度COPD組22例，男11例，女11例，年齡48～78歲，平均（66±14）歲；重度COPD組24例，男13例，女11例，年齡42～76歲，平均（63±12）歲。所有入選對(duì)象均行肺功能檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）支氣管哮喘；（2）有嚴(yán)重心、肝、腎功能不全及惡性腫瘤；（3）有吸煙史或戒煙少于1年。選擇同期健康體檢中心20例健康體驗(yàn)者為對(duì)照組，男12例，女8例，年齡38～78歲，平均（64±12）歲。各組患者性別、年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 ELISA酶聯(lián)免疫分析試劑盒（購(gòu)自美國(guó)R&D公司，DRE12200、DRE10045、DRE10203），酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS公司352型），洗板機(jī)（芬蘭Thermo Labsystems公司AC8型），微量高速離心機(jī)（國(guó)產(chǎn)TG16W型）,隔水式恒溫培養(yǎng)箱（國(guó)產(chǎn)GNP-9080型）。

1.3 方法 抽取外周血6ml，立即加入有EDTA抗凝劑試管，混合10～20min后，離心20min（2 000～3 000r/min）。收集上清液，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。血漿置于-80℃冷凍冰箱，待ELISA檢測(cè)。ELISA檢測(cè)步驟：應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中人HDAC2水平；使用免疫比濁法測(cè)定炎癥蛋白CRP、PCT濃度。操作方法按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法嚴(yán)格執(zhí)行，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 4組患者外周血炎癥蛋白CRP和PCT濃度的比較見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，隨COPD急性加重期患者病情加重，外周血炎癥蛋白CRP和PCT水平均明顯升高，各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；進(jìn)一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 4組患者外周血HDAC2濃度比較 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，隨著病情的加重，HDAC2水平逐漸下降。與對(duì)照組比較，輕、中、重度COPD組患者外周血HDAC2水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。2.3 輕、中、重度COPD組患者外周血HDAC2表達(dá)水平和CRP、PCT的相關(guān)性 輕、中、重度COPD組外周血HDAC2表達(dá)水平與PCT表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.236、-0.258、-0.314，均P＜0.05），其與CRP水平無(wú)明顯相關(guān)（r=-0.145、-0.173、-0.167，均P＞0.05）。

表1 4組患者外周血炎癥蛋白CRP和PCT濃度的比較

表2 4組間外周血HDAC2水平比較

3 討論

目前已知組蛋白脫乙?；福℉DACs）共有17個(gè)亞型,大致分屬Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)2個(gè)不同種屬的核酶家族。Ⅰ類(lèi)HDACs主要存在于細(xì)胞核內(nèi),包括1、2、3和8等4個(gè)亞型,Ⅱ類(lèi)則包括4、5、6、7、9和10等6個(gè)亞型。HDAC2在皮質(zhì)類(lèi)固醇治療中起著舉足輕重的作用，能減少類(lèi)固醇激素治療的不敏感性，并通過(guò)使組蛋白分子末端第5個(gè)賴(lài)氨酸殘基脫乙?；饔檬怪畮д姾?因此分子與組蛋白的結(jié)合變得更為緊密,阻斷了轉(zhuǎn)錄復(fù)合物與特定序列的結(jié)合。相反，HAT通過(guò)乙酰化修飾組蛋白分子末端賴(lài)氨酸殘基,使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變松散,出現(xiàn)解鏈效應(yīng)，基因序列向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物開(kāi)放,啟動(dòng)特定基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[2]。Ito等[5]檢測(cè)來(lái)自COPD患者的肺組織標(biāo)本和肺泡灌洗液巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著COPD病情的加重，肺組織和巨噬細(xì)胞HDAC2活性下降，HDAC mRNA表達(dá)和酶合成降低，說(shuō)明HDAC活性水平與COPD病情嚴(yán)重程度存在顯著的負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著COPD患者病情加重，HDAC2表達(dá)水平逐漸降低，且與PCT呈負(fù)相關(guān)。

PCT是無(wú)激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，由116個(gè)氨基酸組成，分子量為13KD的糖蛋白[6]，可選擇性地對(duì)系統(tǒng)性細(xì)菌、真菌及寄生蟲(chóng)感染發(fā)生反應(yīng)，而對(duì)無(wú)菌性炎癥和病毒感染無(wú)反應(yīng)或僅有輕度反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，全身性細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)感染時(shí)，PCT水平異常增高，增高的程度與感染的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)[7-8]。CRP是由于能與肺炎球菌莢膜的C2多糖物質(zhì)發(fā)生沉淀反應(yīng)而得名[9]。PCT和CRP均為機(jī)體炎癥反應(yīng)敏感指標(biāo)，但PCT不受機(jī)體免疫狀態(tài)影響，其濃度升高程度和感染嚴(yán)重程度呈正相關(guān),具有敏感性高，特異性好的特點(diǎn)。

本研究對(duì)輕、中、重度COPD組和對(duì)照組比較，發(fā)現(xiàn)隨著病情的加重，炎癥指標(biāo)明顯升高，且各組間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），說(shuō)明隨著COPD病情加重，其炎癥反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，炎癥介質(zhì)的增多和炎癥反應(yīng)自我增強(qiáng)、放大，最終造成COPD患者氣管炎癥長(zhǎng)期持續(xù)和進(jìn)行加重，與Rahman等[10]研究結(jié)果一致。

HDAC2表達(dá)水平隨著COPD患者病情的加重而逐漸下降，與PCT呈負(fù)相關(guān)，提示其可能是COPD患者炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子。因此對(duì)外周血HDAC2表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)有助于對(duì)COPD疾病嚴(yán)重程度的判斷，對(duì)臨床病情分析及基因位點(diǎn)干預(yù)治療具有重要意義。

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Histone deacetylase 2 levels in peripheral blood of patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease

ObjectiveTo investigate histone deacetylase 2 (HDAC2)levels in peripheral blood of patients with acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease(COPD)．MethodsSixty-seven patients with COPD in acute exacerbation were enrolled in the study．Lung function tests were performed to evaluate disease severity and patients were classified as mild, moderate and severe groups．Twenty healthy subjects served as controls．The HDAC2 levels were measured by ELISA．The inflammatory proteins C-reactive protein (CRP)and procalcitonin (PCT)were measured by immunoturbidimetric assay．ResultsThe CRP and PCT levels were increased in COPD patients as compared to healthy controls．The HDAC2 levels in mild,moderate and severe groups were 6．93±1．25,6．42±1．46 and 3．79±1．12,respectively(P＜0．01)．HDAC2 level was negatively correlated with inflammatory protein PCT(P＜0．05)．ConclusionHDAC2 levels are decreased in peripheral blood of COPD patients and correlated with the severity of disease,indicating that it may be a negative regulator of inflammatory response in patients with COPD．

Chronic obstructive pulmonary disease Histone deacetylase Procalcitonin C-reactive protein

2012-07-03）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

溫州市科技局資金自籌項(xiàng)目（Y20110159）

325200 瑞安市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

葉瑞海，E-mail:yehoo2003@163.com