尹俊濱, 張 婷, 周科成, 王莉穎, 夏 亮, 胡 偉, 王 文*

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福爾馬林致痛后小鼠不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

尹俊濱1, 張 婷1, 周科成2, 王莉穎1, 夏 亮3, 胡 偉1, 王 文1*

（第四軍醫(yī)大學(xué):1人體解剖與組織胚胎學(xué)教研室, 梁銶琚腦研究中心;3航空航天醫(yī)學(xué)系心理學(xué)教研室, 西安 710032;2中國(guó)藥科大學(xué)中藥復(fù)方研究室, 南京 211198）

探討小鼠足底注射福爾馬林致痛后不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)情況。將5%福爾馬林溶液注射到小鼠后肢足底皮下，觀察注射后60min內(nèi)小鼠的自發(fā)痛反應(yīng)；用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察注射后2h同側(cè)脊髓背角及不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元的分布情況和數(shù)量。行為學(xué)結(jié)果顯示：注射福爾馬林60min后小鼠的舔/咬足時(shí)間及縮足次數(shù)呈現(xiàn)典型的雙相變化。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：注射福爾馬林2h后同側(cè)脊髓背角、下丘腦室旁核、丘腦中間背側(cè)核、前扣帶回皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)及杏仁核內(nèi)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增加，同時(shí)海馬齒狀回區(qū)FOS蛋白的表達(dá)也有一定程度的增加。在受到傷害性疼痛刺激時(shí)除了脊髓背角，感受疼痛、應(yīng)激及做出防御反應(yīng)的相應(yīng)腦區(qū)也會(huì)被活化，表達(dá)FOS蛋白。

c-fos; FOS蛋白; 福爾馬林痛; 免疫組織化學(xué)染色; 腦內(nèi)核團(tuán)

C-fos是細(xì)胞基因組的一種原癌基因，在神經(jīng)元興奮后可以迅速并且短暫地表達(dá)FOS蛋白，因此也被稱為即刻早期基因（immediate early genes，IEGs）[1,2]。FOS蛋白被認(rèn)作是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的第三信使，可以促進(jìn)許多與疼痛及鎮(zhèn)痛相關(guān)基因的表達(dá)[3]。FOS蛋白在神經(jīng)元受到多種刺激（尤其是傷害性刺激）后會(huì)迅速地表達(dá)，因此，被廣泛地認(rèn)為是一種神經(jīng)元功能活化的標(biāo)志[4]。

福爾馬林致痛模型是將5%福爾馬林注射到動(dòng)物足底皮下，觀察注射后1h內(nèi)的自發(fā)痛反應(yīng)，是一種常用的炎性痛模型。既往已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，傳遞傷害性疼痛刺激的初級(jí)中樞脊髓背角在足底注射福爾馬林2h后會(huì)有大量的FOS蛋白表達(dá)[5-7]。同時(shí)，大腦作為高級(jí)中樞，在未成年大鼠足底注射福爾馬林以及成年大鼠在給予足底電刺激后，其腦內(nèi)與感受疼痛刺激直接相關(guān)的核團(tuán)也會(huì)有大量FOS蛋白的表達(dá)[8,9]。但疼痛所帶來(lái)的不僅是一種傷害性的刺激，還會(huì)伴隨著機(jī)體的應(yīng)激和發(fā)生情緒的改變（如恐懼），同時(shí)機(jī)體也會(huì)對(duì)刺激做出相應(yīng)的防御性反應(yīng)等[8,10]。在疼痛刺激后腦內(nèi)與這些應(yīng)激、情緒、學(xué)習(xí)、記憶及產(chǎn)生防御反應(yīng)的核團(tuán)是否也會(huì)活化，并表達(dá)FOS蛋白呢？足底注射福爾馬林后成年小鼠腦內(nèi)核團(tuán)的活化情況是怎樣的？這些都需要去驗(yàn)證和篩查。

老年人由于器官的退行性改變、損傷及腫瘤等原因而常常伴隨著疼痛的發(fā)生。因老年人的耐受性較強(qiáng)，往往能夠忍受疼痛而忽視治療，長(zhǎng)時(shí)間的疼痛會(huì)使人產(chǎn)生情緒及性格的改變，如出現(xiàn)睡眠紊亂、食欲缺乏，導(dǎo)致焦慮、抑郁、精神崩潰，甚至人格扭曲等，嚴(yán)重影響患者的心理、社會(huì)功能，致使不少患者因無(wú)法長(zhǎng)期忍受而選擇自殺。故通過(guò)本研究希望發(fā)現(xiàn)疼痛導(dǎo)致這些嚴(yán)重后果的解剖基礎(chǔ)，為今后臨床探尋更好的治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性C57BL/6小鼠（購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），8～10周齡，體質(zhì)量18～22g，飼養(yǎng)室溫度恒定22℃±2℃并保證12h的光照，自由攝取食物和水。所有實(shí)驗(yàn)在第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 福爾馬林痛模型

用微量注射器（Hamilton. NV，USA）30G的針頭，在小鼠右側(cè)后足趾側(cè)注射生理鹽水（生理鹽水組）或5%福爾馬林溶液（溶于生理鹽水）25μl（5%福爾馬林組）。注射后立即將小鼠置于透明的玻璃罩（25cm×25cm×40cm）中，通過(guò)視頻捕捉系統(tǒng)記錄注射福爾馬林溶液后60min內(nèi)小鼠的自發(fā)痛行為。經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)者通過(guò)計(jì)數(shù)表和秒表分別統(tǒng)計(jì)小鼠回縮注射足的次數(shù)和舔/跤注射足的時(shí)間，用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠疼痛的程度。

1.3 取材

福爾馬林溶液注射2h后，腹腔注射過(guò)量的戊巴比妥鈉（3%，0.1ml）將小鼠深麻醉后迅速開(kāi)胸，先用50ml 0.9%的生理鹽水沖去體內(nèi)殘血，然后以含4%多聚甲醛的0.1mol/L PB（pH＝7.3）100ml灌注固定約1h。將脊髓腰5節(jié)段及大腦取出放于相同的固定液中后固定3h，隨后將組織置于30%的蔗糖溶液中4℃脫水。待組織沉底后取出，用恒冷箱切片機(jī)（Kryostat 1720；Leitz，Mannheim，Germany）將脊髓和大腦橫切，切片厚度為25μm，分別連續(xù)切片收集于3個(gè)孔中，每個(gè)孔中包含一套完整的切片。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

每只小鼠取一套片子采用ABC法進(jìn)行FOS染色，具體步驟：（1）用0.01mol/L PBS溶液漂洗3遍，每遍10min；（2）用含2%山羊血清和0.3%Triton X-100的0.01mol/L PBS溶液在常溫下封閉1h；（3）一抗Mouse-A-FOS（1∶500；Abcam，UK）加入含5%驢血清、0.3%TritonX-100、0.05%疊氮鈉和0.25%角叉菜膠的0.01mol/L PBS溶液，4℃孵育過(guò)夜；（4）二抗Bio-Goat-A-Mouse IgG （1∶200；Vector，Burlingame，CA，USA）加入含5%驢血清、0.3%TritonX-100、0.05%疊氮鈉和0.25%角叉菜膠的0.01mol/LPBS溶液，常溫下孵育4h；（5）Avidin-Biotin-peroxidase complex（ABC）Elite Kit （1∶100；Vector）加入0.01mol/L PBS溶液中，常溫下孵育1h；（6）最后將切片放入含0.04%二氨基聯(lián)苯胺（DAB）和0.003%雙氧水的0.05mol/L Tris-HCL中反應(yīng)至FOS顯色。上述的每一步間都需用0.01mol/L PBS溶液漂洗3遍，每遍10min。

陰性對(duì)照：從足底注射福爾馬林后的小鼠切片中取一套片子，按照上述步驟分別漂洗、封閉和加入抗體，但不加入一抗，最后采用ABC法進(jìn)行顯色，觀察。

1.5 FOS蛋白表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元計(jì)數(shù)

在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠脊髓背角及腦內(nèi)核團(tuán)FOS蛋白的表達(dá)，并拍攝。由另外一名實(shí)驗(yàn)人員計(jì)數(shù)各組小鼠脊髓背角和各個(gè)核團(tuán)內(nèi)FOS蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量，選取有能代表該核團(tuán)的切片進(jìn)行計(jì)數(shù)，每只小鼠至少計(jì)數(shù)5張切片，然后取平均值作為此只小鼠FOS蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元的平均數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 福爾馬林痛小鼠的自發(fā)痛行為及脊髓背角內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

C57BL/6小鼠右側(cè)后足足底皮下注射5%福爾馬林溶液后可以產(chǎn)生雙相自發(fā)痛反應(yīng)，包括自發(fā)的舔/咬注射足底和回縮注射足。無(wú)論是每5min內(nèi)舔/咬足時(shí)間還是縮足次數(shù)在前5min都達(dá)到高峰，后5min減弱，這就是第一個(gè)短暫的時(shí)相，持續(xù)10min；緊接著第二個(gè)時(shí)相從注射后10min開(kāi)始，持續(xù)到約60min（圖1）。而足底注射生理鹽水的小鼠除注射引起的短暫疼痛外，無(wú)自發(fā)性痛行為的表現(xiàn)。

圖1 足底注射福爾馬林后1h內(nèi)的自發(fā)痛行為

Figure 1 Spontaneous pain behavior within 1 hour of formalin injection

C57BL/6小鼠足底注射福爾馬林2h后脊髓背角內(nèi)有大量FOS蛋白的表達(dá)。傷害性疼痛刺激的初級(jí)傳入中樞是脊髓的背角，足底注射福爾馬林后可以活化脊髓背角（spinal dorsal horn，SDH）內(nèi)的疼痛感受性神經(jīng)元，激活其基因組內(nèi)的c-fos基因表達(dá)FOS蛋白。FOS蛋白經(jīng)DAB顯色后為棕黃色的亮點(diǎn)，主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。FOS蛋白陽(yáng)性的神經(jīng)元不僅分布于脊髓背角的淺層，同時(shí)也存在于深層。而足底注射生理鹽水組小鼠脊髓背角內(nèi)表達(dá)FOS蛋白陽(yáng)性的神經(jīng)元的數(shù)量相對(duì)較少（＜0.01；圖2）

2.2 足底注射福爾馬林2h后腦內(nèi)核團(tuán)FOS蛋白的分布

高倍鏡下FOS蛋白陽(yáng)性的神經(jīng)元中，棕黃色著色即為神經(jīng)元細(xì)胞核，胞質(zhì)未見(jiàn)著色。足底注射福爾馬林后在腦內(nèi)許多核團(tuán)可以看到明顯增多的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元。在丘腦中間背側(cè)核（medial dorsal thalamic nucleus，MDTN）、下丘腦的室旁核（paraventricular nucleus，PVN）和背側(cè)區(qū)、島葉（insular cortex，IC）、前扣帶回皮質(zhì)（anterior cingulate cortex，ACC）及杏仁核（amygdala）海馬的CA1區(qū)和齒狀回（dentate gyrus，DG）都可見(jiàn)到FOS蛋白的表達(dá)增多（表1）。

足底注射生理鹽水后在MDTN及下丘腦的PVN處可見(jiàn)到少量的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元，胞核為棕黃色，胞質(zhì)陰性，染色淺，散在分布。注射福爾馬林溶液2h后FOS蛋白表達(dá)明顯增多（＜0.01），F(xiàn)OS陽(yáng)性神經(jīng)元密集分布于整個(gè)核團(tuán)（圖3）。

足底注射生理鹽水后在ACC、IC和杏仁核處均可見(jiàn)到少量的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布，注射福爾馬林溶液2h后FOS蛋白表達(dá)明顯增多（＜0.01），ACC和杏仁核中FOS陽(yáng)性神經(jīng)元密集分布于整個(gè)核團(tuán)，IC內(nèi)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布密度也較高（圖4）。

足底注射生理鹽水在海馬內(nèi)CA1區(qū)和DG區(qū)偶見(jiàn)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元散在分布，染色較淺，注射福爾馬林溶液2h后CA1區(qū)內(nèi)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元仍散在分布，與生理鹽水組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），而DG區(qū)內(nèi)的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元有一定程度的增加（＜0.05），仍是散在分布（圖5）。

表1 脊髓背角及各腦區(qū)內(nèi)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量

SDH: 脊髓背角; PVN: 下丘腦的室旁核; MDTN: 丘腦中間背側(cè)核; ACC: 前扣帶回皮質(zhì); Amygdala: 杏仁核; IC: 島葉; DG: 齒狀回。與生理鹽水組比較,P＜0.05,P＜0.01

3 討 論

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法探討了在C57BL/6小鼠足底注射5%福爾馬林溶液后，神經(jīng)元活化的標(biāo)志物FOS蛋白在SDH及大腦核團(tuán)內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，足底注射福爾馬林后可以引起明顯的雙相自發(fā)痛行為，在注射2h后SDH內(nèi)FOS陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增加，在丘腦、下丘腦、杏仁核、ACC及IC都有大量FOS蛋白的表達(dá)，而海馬CA1區(qū)和DG區(qū)的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元增加不明顯。

圖2 足底注射福爾馬林2h后同側(cè)脊髓背角內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

Figure 2 Expression of FOS protein in ipsilateral SDH after 2 hours of formalin injection (scale bar＝50μm)

A: 陰性對(duì)照組; B: 生理鹽水組; C: 5%福爾馬林組

圖3 足底注射福爾馬林2h后丘腦和下丘腦核團(tuán)內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

Figure 3 Expression of FOS protein in nucleus of thalamus and hypothalamus after 2 hours of formalin injection

A, B, A', B': 生理鹽水組; A'', B'': 5%福爾馬林組。MDTN: 丘腦中間背側(cè)核, PVN: 下丘腦室旁核

圖4 足底注射福爾馬林2h后前扣帶回和島葉皮質(zhì)及杏仁核內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

Figure 4 Expression of FOS protein in ACC and Amygdala after 2 hours of formalin injection

A, B, C, A’, B’, C’; 生理鹽水組; A”, B”, C”: 5%福爾馬林組。ACC: 前扣帶回皮質(zhì); IC: 島葉皮質(zhì); Amygdala: 杏仁核

福爾馬林痛模型是常用的急性炎性痛模型。足底注射福爾馬林引起的雙相自發(fā)痛行為中，第一相被認(rèn)為是由直接的機(jī)械性組織損傷引起的急性痛行為，而第二相則是由注射入的福爾馬林引起的炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的持續(xù)性痛行為。而第二相的行為表現(xiàn)與炎性疼痛刺激的強(qiáng)度呈正相關(guān)。

機(jī)體細(xì)胞在受到多種傷害性因素（如物理刺激、化學(xué)刺激等）的刺激后可誘導(dǎo)胞核內(nèi)原癌基因c-fos表達(dá)FOS蛋白。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)c-fos很少表達(dá)，疼痛刺激可以激活SDH內(nèi)與感受痛覺(jué)相關(guān)的神經(jīng)元的c-fos并表達(dá)FOS蛋白。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，細(xì)胞核內(nèi)基因組轉(zhuǎn)錄的c-fos mRNA轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，由核糖體翻譯為FOS蛋白，F(xiàn)OS蛋白與Jun蛋白合成二聚體，在AP-1的介導(dǎo)下易位到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在一定程度上，F(xiàn)OS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量與所受的刺激強(qiáng)度成正比。c-fos基因是一種“即刻表達(dá)基因”，F(xiàn)OS蛋白在受到刺激1h后就可有明顯的反應(yīng)。已有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠足底皮下注射福爾馬林后2h同側(cè)SDH FOS蛋白表達(dá)達(dá)到最高峰[11]。因此，筆者選擇在足底注射福爾馬林2h后來(lái)觀察SDH及大腦各區(qū)域內(nèi)FOS蛋白表達(dá)的數(shù)量。Roussy等[12]報(bào)道足底注射福爾馬林后在SDH的淺層和深層都有FOS蛋白的表達(dá)，包括Ⅰ～Ⅵ層的神經(jīng)元和Ⅹ層的神經(jīng)元。但主要還是集中在SDH的Ⅰ層和Ⅱ?qū)拥耐鈧?cè)。

圖5 足底注射福爾馬林2h后海馬內(nèi)FOS蛋白的表達(dá)

Figure 5 Expression of FOS protein in hippocamus after 2 hours of formalin injection

A, B, A’, B’: 生理鹽水組; A”, B”: 5%福爾馬林組

受到傷害性刺激后，脊髓上位中樞特別是腦內(nèi)神經(jīng)核團(tuán)的活化也有許多的研究。在大鼠內(nèi)臟痛模型中，無(wú)論是因彌漫性腹膜炎，亦或是較局限的膀胱炎癥所引發(fā)的內(nèi)臟痛，在其延髓腹外側(cè)區(qū)、臂旁核、中縫背核、中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)、杏仁核、皮層、丘腦和下丘腦的許多核團(tuán)都可以發(fā)現(xiàn)FOS陽(yáng)性的神經(jīng)元[13]。內(nèi)臟痛與軀體痛在脊髓中的初級(jí)中樞雖然不同，但是在腦內(nèi)應(yīng)該有許多相同的高位中樞可以對(duì)疼痛刺激做出反應(yīng)。

PVN和MDTN核被認(rèn)為與面對(duì)危險(xiǎn)或刺激時(shí)自主反應(yīng)的形成相關(guān)[8]。足底注射福爾馬林后，活化的不僅是與感受疼痛相關(guān)的大腦區(qū)域。小鼠在受到應(yīng)激后也會(huì)做出相應(yīng)的本能反應(yīng)，因此與這種防御反應(yīng)相關(guān)的PVN和MDTN中也有大量的FOS蛋白表達(dá)。

大量的研究證明ACC與疼痛、記憶及情緒有密切的關(guān)系[14]。PET檢查顯示，傷害性刺激和與疼痛相關(guān)的不愉快的事件都可引起大腦內(nèi)ACC、杏仁核及IC的活化[15,16]。臨床上，手術(shù)損毀ACC及其附近的皮層可以顯著地降低患者因疼痛引起的煩躁不安[17]。同時(shí)，大量的神經(jīng)影像學(xué)方法研究了在抑郁和疼痛時(shí)不同腦區(qū)的活化和改變，發(fā)現(xiàn)疼痛時(shí)IC和ACC都有明顯的活化，IC、ACC、感覺(jué)皮質(zhì)和前額葉皮質(zhì)被稱為“the pain matrix”[18,19]。一項(xiàng)薈萃分析顯示IC參與了抑郁癥時(shí)對(duì)情緒刺激的反應(yīng)[20]。也有實(shí)驗(yàn)證明杏仁核參與條件性恐懼及疼痛的過(guò)程[21,22]。因此在足底注射福爾馬林后，產(chǎn)生的疼痛刺激以及恐懼情緒等都可活化ACC、IC、杏仁核內(nèi)的神經(jīng)元使其表達(dá)FOS蛋白。

海馬的功能主要與學(xué)習(xí)記憶的形成及情緒的形成相關(guān)。足底注射福爾馬林作為一種急性的疼痛刺激，引起的海馬神經(jīng)元活化相對(duì)于其他核團(tuán)較少。Ceccarelli等[23]曾經(jīng)比較了大鼠足底注射福爾馬林2h后CA1區(qū)和DG區(qū)在雌性和雄性間的區(qū)別。注射福爾馬林2h后，在CA1區(qū)雌性大鼠的FOS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量少于對(duì)照組而雄性與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同樣，在DG區(qū)雌性大鼠與對(duì)照組比較，F(xiàn)OS陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)量無(wú)明顯差異，而雄性大鼠FOS蛋白的表達(dá)要多于對(duì)照組，與本實(shí)驗(yàn)中所觀察到的基本相符。但是持續(xù)的慢性疼痛刺激是否會(huì)大量地活化海馬內(nèi)神經(jīng)元，還有待后續(xù)的慢性疼痛實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)。

疼痛刺激不僅活化了脊髓和腦內(nèi)與感受痛覺(jué)相關(guān)的核團(tuán)，而且也活化了與應(yīng)激、情緒、學(xué)習(xí)、記憶及產(chǎn)生防御反應(yīng)相關(guān)的PVN、MDTN、ACC、IC、杏仁核和海馬的DG區(qū)。本研究為疼痛引起情緒、性格改變，影響學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制研究提供了形態(tài)學(xué)的證據(jù)。為今后在臨床工作中對(duì)老年人特別是有多器官疾病耐受疼痛的老年人及時(shí)治療疼痛，解除疼痛提供了強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

[1] Dragunow M, Faull R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing[J]. J Neurosci Methods, 1989, 29(3): 261-265.

[2] Sagar SM, Sharp FR, Curran T. Expression of c-fos protein in brain: metabolic mapping at the cellular level[J]. Science, 1988, 240(4857): 1328-1331.

[3] Coggeshall RE. Fos, nociception and the dorsal horn[J]. Prog Neurobiol, 2005, 77(5): 299-352.

[4] Hunt SP, Pini A, Evan G. Induction of c-fos-like protein in spinal cord neurons following sensory stimulation[J]. Nature, 1987, 328(6131): 632-634.

[5] Zhao H, Sugawara T, Miura S,. Intrathecal landiolol inhibits nociception and spinal c-Fos expression in the mouse formalin test[J]. Can J Anaesth, 2007, 54(3): 201-207.

[6] Liu CR, Duan QZ, Wang W,. Effects of intrathecal isoflurane administration on nociception and Fos expression in the rat spinal cord[J]. Eur J Anaesthesiol, 2011, 28(2): 112-119.

[7] Bai L, Wang W, Dong YL,. Attenuation of mouse somatic and emotional inflammatory pain by hydralazine through scavenging acrolein and inhibiting neuronal activation[J]. Pain Physician, 2012, 15(4): 311-326.

[8] Barr GA. Formalin-induced c-fos expression in the brain of infant rats[J]. J Pain, 2011, 12(2): 263-271.

[9] Lehner M, Taracha E, Skorzewska A,. Sensitivity to pain and c-Fos expression in brain structures in rats[J]. Neurosci Lett, 2004, 370(1): 74-79.

[10] Twillman RK. Mental disorders in chronic pain patients[J]. J Pain Palliat Care Pharmacother, 2007, 21(4): 13-19.

[11] Sun X, Yokoyama M, Mizobuchi S,. The effects of pretreatment with lidocaine or bupivacaine on the spatial and temporal expression of c-Fos protein in the spinal cord caused by plantar incision in the rat[J]. Anesth Analg, 2004, 98(4): 1093-1098.

[12] Roussy G, Dansereau MA, Dore-Savard L,. Spinal NTS1 receptors regulate nociceptive signaling in a rat formalin tonic pain model[J]. J Neurochem, 2008, 105(4): 1100-1114.

[13] Rodella L, Rezzani R, Gioia M,. Expression of Fos immunoreactivity in the rat supraspinal regions following noxious visceral stimulation[J]. Brain Res Bull, 1998, 47(4): 357-366.

[14] Gao YJ, Ren WH, Zhang YQ,. Contributions of the anterior cingulate cortex and amygdala to pain-and fear-conditioned place avoidance in rats[J]. Pain, 2004, 110(1-2): 343-353.

[15] Bornhovd K, Quante M, Glauche V,. Painful stimuli evoke different stimulus-response functions in the amygdala, prefrontal, insula and somatosensory cortex: a single-trial fMRI study[J]. Brain, 2002, 125(Pt 6): 1326-1336.

[16] Tolle TR, Kaufmann T, Siessmeier T,. Region-specific encoding of sensory and affective components of pain in the human brain: a positron emission tomography correlation analysis[J]. Ann Neurol, 1999, 45(1): 40-47.

[17] Foltz EL, White LE Jr. Pain “relief” by frontal cingulumotomy[J]. J Neurosurg, 1962, 19(1): 89-100.

[18] Mutschler I, Ball T, Wankerl J,. Pain and emotion in the insular cortex: evidence for functional reorganization in major depression[J]. Neurosci Lett, 2012, 520(2): 204-209.

[19] Tracey I. Nociceptive processing in the human brain[J]. Curr Opin Neurobiol, 2005, 15(4): 478-487.

[20] Delaveau P, Jabourian M, Lemogne C,. Brain effects of antidepressants in major depression: a meta-analysis of emotional processing studies[J]. J Affect Disord, 2011, 130(1-2): 66-74.

[21] Maren S, Fanselow MS. The amygdala and fear conditioning: has the nut been cracked[J]. Neuron, 1996, 16(2): 237-240.

[22] Buritova J, Besson JM, Bernard JF. Involvement of the spinoparabrachial pathway in inflammatory nociceptive processes: a c-Fos protein study in the awake rat[J]. J Comp Neurol, 1998, 397(1): 10-28.

[23] Ceccarelli I, Scaramuzzino A, Aloisi AM. Effects of formalin pain on hippocampal c-Fos expression in male and female rats[J]. Pharmacol Biochem Behav, 1999, 64(4): 797-802.

（編輯: 王雪萍）

FOS expression in supraspinal regions after formalin-induced pain in mice

YIN Jun-Bin1, ZHANG Ting1, ZHOU Ke-Cheng2, WANG Li-Ying1, XIA Liang3, Hu Wei1, WANG Wen1*

(1Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, K.K. Leung Brain Research Centre, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China;2Department of Complex Prescription of TCM, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China;3Department of Psychology, Institute of Aerospace Medicine, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

To investigate the expression profiles of FOS protein in the mice brain subregions induced by subcutaneous formalin injection to one hindpaw.After adult mice received an injection of 5% formalin in the hindpaw, their spontaneous pain behaviors were recorded within 60min. The expression, distribution and number of FOS-positive neurons in the ipsilateral dorsal horn and supraspinal regions were detected by immunohistochemical assay at two hours after formalin injection.These mice showed their biting/licking time and flinches in a typical two-phase manner within 60min. The immunohistochemical staining results showed that FOS-positive neurons were significantly increased in the ipsilateral spinal cord, paraventricular nucleus, medial dorsal thalamic nucleus, anterior cingulate cortex, insular cortex and amygdala. Meanwhile, the expression of FOS protein in the dentate gyrus of hippocampus was also slightly increased.Not only spinal dorsal horn but also subregions sensitive to pain and stress, will be activated functionally to mediate defensive response when mice are exposed to nociceptive stimuli.

c-fos; FOS protein; formalin-induced pain; immunohistochemical staining; nucleus of brain.

(31070976).

R741.02

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00112

2012-12-19;

2013-03-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31070976）

張婷, 為共同第一作者

王 文, Tel: 029-84774504, E-mail: wangwen@fmmu.edu.cn