鄭吉龍李曉娜張 岷含溫洪洋官大威

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 遼寧 沈陽 110001）

死后不同時(shí)間對(duì)小鼠皮膚切創(chuàng)組織中CB2R檢測(cè)影響的研究

鄭吉龍1李曉娜2張 岷含1溫洪洋1官大威2

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035；2 中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 遼寧 沈陽 110001）

為觀察不同死后間隔時(shí)間對(duì)CB2R檢測(cè)的影響，本文應(yīng)用Western blot和Real-Time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了40只健康成年雄性BALB/c小鼠在生前皮膚切創(chuàng)5d處死后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)CB2R表達(dá)變化的影響。發(fā)現(xiàn)小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中，CB2R表達(dá)變化具有時(shí)間規(guī)律性，并且死后6h內(nèi)CB2R穩(wěn)定存在于皮膚組織中，有望用于皮膚損傷時(shí)間的推斷。

皮膚損傷 CB2R Western blotReal-TimeRT-PCR 死亡時(shí)間

損傷時(shí)間推斷，對(duì)劃定嫌疑人的范圍、現(xiàn)場(chǎng)重建及判斷死亡方式等，均有重要意義，可以為案件的偵破與審理提供可靠的醫(yī)學(xué)證據(jù)，一直是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法主要是根據(jù)損傷局部病理組織學(xué)改變，局部酶的活性的改變以及炎性介質(zhì)的生物化學(xué)檢測(cè)來推斷損傷時(shí)間。為了尋求更精確、更可靠的判斷指標(biāo)，近年來國(guó)內(nèi)外許多法醫(yī)學(xué)者應(yīng)用免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)創(chuàng)傷愈合中相關(guān)因子進(jìn)行了諸多研究，研究證實(shí)bFGF、VEGF、TGF-131、fibronectin、TGF-a、IL-6等在創(chuàng)傷愈合中的表達(dá)均具有時(shí)間規(guī)律性變化，有望作為法醫(yī)學(xué)損傷時(shí)間的判斷指標(biāo)。法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中往往不能在人死后立即進(jìn)行解剖、取材，以往的實(shí)驗(yàn)性研究也均未涉及到死后因素對(duì)各檢測(cè)指標(biāo)的影響，故很少考慮到死后變化對(duì)于所研究指標(biāo)的影響。某些可以用于損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)，很可能由于死后變化的影響而失去其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中CB2R受體表達(dá)和分布的時(shí)序變化的基礎(chǔ)上，研究小鼠皮膚切創(chuàng)后死后早期時(shí)間內(nèi)對(duì)CB2R檢出時(shí)限的影響，以探討其在法醫(yī)實(shí)踐中用于推斷損傷時(shí)間的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 試劑和材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年雄性BALB/c小鼠40只，體重30g～35g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑和材料

6條帶預(yù)染蛋白Marker（Fermentas公司，立陶宛）、硝酸纖維素膜（PVDF膜，Millipore公司，美國(guó)）、乙二胺四乙酸二鈉（廣州化學(xué)試劑廠）、ECL發(fā)光試劑盒（Santa Cruz公司，美國(guó)）、β-actin引物（Takara公司，中國(guó)）、CB2R引物（Takara公司，中國(guó)）、PrimeScriptTMRT reagents Kit(Perfect Real Time)(DRR037S)（Takara公司，中國(guó)）、SYBR? Premix Ex TaqTMΙΙ(Perfect Real Time， DRR081S，Takara公司，中國(guó)）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

勻漿儀 （IKA公司，德國(guó)）、電泳儀（BIO-RAD）、轉(zhuǎn)印儀（BIO-RAD）、酶標(biāo)光度計(jì)（Tecan公司，瑞士）、紫外可見光分光光度計(jì)（Implen公司，德國(guó)）、電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（DNR Bio-Imaging Systems公司，以色列）、Real Time RT-PCR擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制作

為觀察死后不同時(shí)間對(duì)CB2R檢測(cè)的影響，另取健康成年雄性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量30g～35g，隨機(jī)分為8組，每組均為5只小鼠。在生前傷5d后脫頸椎處死，置22℃室溫，濕度70%，以死后放置時(shí)間不同，分別于死后0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d提取皮膚樣本進(jìn)行Western blot和Real-Time RT-PCR方法的檢測(cè)。

1.2.2 Western blot技術(shù)檢測(cè)

1.2.2.1 蛋白樣品制備

將剪碎的皮膚組織檢材放入2ml EP管中，加入裂解液（組織與裂解液體積比為1∶3）和苯甲基磺酰氟化物（PMSF）；冰上勻漿，超聲破碎；4℃條件下12000r/min（離心半徑9.35cm）離心30min，提取上清液；BCA法進(jìn)行蛋白定量；計(jì)算每個(gè)損傷時(shí)間組含50μg總蛋白所需樣品體積，-20℃保存。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

灌膠：灌注12%分離膠，待分離膠凝固后，再灌注5%濃縮膠；蛋白變性：樣品加適量比例上樣緩沖液，混勻置于 100℃金屬浴中加熱 5min，離心3000r/min，20s；上樣：向泳道內(nèi)加入20μl樣品（含40μg總蛋白）及分子量Marker；12%SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓設(shè)置為40V，時(shí)間30min，分離膠電壓設(shè)置為100V，時(shí)間100min；剝膠后把膠置于轉(zhuǎn)印緩沖液中，搖床中浸濕15min后將濾紙浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡；將PVDF膜放在甲醇中浸泡5min后，放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸濕30 min；半干轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)印電壓設(shè)置為 5V，轉(zhuǎn)印時(shí)間 35min；TTBS中洗膜，5min×3次，將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉中，封閉2h，室溫?fù)u床上進(jìn)行；加入一抗（兔抗大鼠CB2R多克隆抗體，1∶400脫脂奶粉稀釋）4ml，塑料薄膜密封，4℃孵育過夜；TTBS中洗膜5min×2次，TBS中5min×1次。然后加入二抗（羊抗兔IgG，1∶6000稀釋）5ml，塑料薄膜密封，室溫孵育2h；TTBS中洗膜5min×2次，TBS中5min×1次，ECL發(fā)光。

1.2.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker作指示，CB2R蛋白在34kD附近顯示陽性譜帶。以GAPDH為內(nèi)參照，利用Scion Image（Scion Corporation，Maryland，USA）軟件檢測(cè)CB2R在各組的相對(duì)蛋白水平，從而進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.3 Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)

1.2.3.1 RNA提取

將剪碎的皮膚組織檢材放入1.5ml EP管中，加入1ml的Trizol溶液，顛倒混勻10下，室溫靜置5min；加入0.2ml氯仿，用力搖晃EP管15s，使其充分混勻，室溫靜置5min，12000r/min離心15min；將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5ml EP管中（約 400μl～500μl），加入0.5ml異丙醇，混勻后放于-20℃中1h，后12000rmp離心10min；小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，7500r/min離心5min；小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開風(fēng)機(jī)吹干，再在管中加20μl的 DEPC水溶解；測(cè)定 OD260/OD280值和RNA濃度，將樣品部分RNA稀釋成0.5μg/μl。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

按PrimeScriptTM RT reagents Kit說明，20μl反應(yīng)體系如下：已配好的RNA工作液（0.5μg/μl）2μl，5×PrimeScript?Buffer 4μl，PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1μl，Oligo dt Primer 1μl，Random 6 mers 1μl，RNase Free dH2O 11μl。加入2ml薄壁PCR反應(yīng)管中，先瞬時(shí)離心混勻，置PCR儀中，37℃孵育15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃孵育5sec（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。

1.2.3.3 Real-Time RT-PCR反應(yīng)

Takara公司設(shè)計(jì)特異性引物見表1。PCR試劑購自Takara公司SYBR?Premix Ex TaqTMΙΙ。應(yīng)用ABI PRISM?7500 Real-Time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μl反應(yīng)體系組成如下：SYBR?Premix Ex TaqTMII 10μl，PCR Forward Primer 0.8μl，PCR Reverse Primer 0.8μl，ROX Reference Dye II 0.4μl，cDNA溶液2μl和dH2O 6.0μl。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：1個(gè)預(yù)變性循環(huán)（95℃，30sec）；40個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)（95℃，5sec；60℃，34sec）。連續(xù)采集熒光信號(hào)繪制融解曲線。

1.2.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)定量 PCR結(jié)果由 ABI PRISM?7500 Real-Time PCR System自動(dòng)采集給出目的基因和參比基因的Ct值，基因表達(dá)量采用實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組=2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算，其中ΔΔCt=(Ct目的-Ct參比)實(shí)驗(yàn)-(Ct目的-Ct參比)對(duì)照。每組中目的基因和參比基因加入的量一致，所以可以對(duì)每個(gè)樣本ΔCt值（Ct目的-Ct參比）采用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間比較后再進(jìn)行2-ΔΔCt計(jì)算倍數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 宏觀形態(tài)學(xué)改變

死后即刻，痂皮與創(chuàng)緣皮膚分離，部分已剝離，創(chuàng)口表面被增生的上皮覆蓋，可見皮下紅色肉芽組織。死后6h～12h創(chuàng)壁變化較小，較濕潤(rùn)；皮膚及皮下組織未見腐敗。死后24h～48h皮膚變薄，創(chuàng)壁略變干，尸體腐敗，尸臭、尸綠出現(xiàn)；取材時(shí)見肌肉部分混濁、變軟。死后3d，尸體腐敗顯著，取材時(shí)見肌肉混濁、變軟。

2.2 CB2R蛋白水平檢測(cè)

以GAPDH（分子量34kD）為內(nèi)參，計(jì)算CB2R蛋白在死后不同時(shí)間組表達(dá)的相對(duì)值（CB2R灰度值/GAPDH灰度值）。CB2R在死后各時(shí)間組均有陽性條帶，CB2R大約位于34kD處，死后各時(shí)間組CB2R蛋白表達(dá)相對(duì)水平有一定規(guī)律（圖1）。和死后0h組比較，死后6h組CB2R蛋白表達(dá)相對(duì)水平開始顯著降低；至死后3d，CB2R蛋白表達(dá)相對(duì)水平降至最低值。CB2R蛋白表達(dá)相對(duì)水平（x±s） 參見圖2，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果參見表2。

圖1 切創(chuàng)后5d皮膚樣本在死后不同時(shí)間點(diǎn)CB2R蛋白的表達(dá)變化

表2 Western blot法檢測(cè)小鼠皮膚切創(chuàng)5d皮膚樣本在死后不同時(shí)間點(diǎn)CB2R蛋白表達(dá)水平（n=5，x±s）

圖2 切創(chuàng)后5d皮膚樣本在死后不同時(shí)間點(diǎn)CB2R蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 Real-time RT-PCR 技 術(shù) 檢 測(cè) CB2R mRNA表達(dá)水平

小鼠切創(chuàng)5d后不同死后間隔時(shí)間CB2R mRNA在皮膚組織中的表達(dá)隨時(shí)間變化結(jié)果見表3。和死后0h組比較，死后6h組CB2R mRNA表達(dá)相對(duì)水平開始降低；至死后3d，CB2R mRNA表達(dá)相對(duì)水平降至最低值。CB2R mRNA表達(dá)相對(duì)水平（x±s）參見圖5，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果參見表3。β-actin和CB2R基因的溶解曲線呈單峰，溶解溫度分別為87℃和83℃（圖3、圖4）。

表3 Real-time PCR法檢測(cè)小鼠皮膚切創(chuàng)5d皮膚樣本在死后不同經(jīng)過時(shí)間CB2R mRNA表達(dá)水平（n=5,x±s）

圖3 β-actin基因的溶解曲線

圖4 CB2R基因的溶解曲線

圖5 切創(chuàng)后5d皮膚樣本在死后不同經(jīng)過時(shí)間CB2R mRNA相對(duì)Ct值

3 討論

在法醫(yī)學(xué)的實(shí)踐中，法醫(yī)病理學(xué)家必須要面對(duì)死后不同時(shí)間段的尸體。隨著死后間隔時(shí)間的增加，許多生物學(xué)物質(zhì)因?yàn)楦瘮』蜃匀艿淖饔枚l(fā)生降解。如果CB2R的蛋白或mRNA水平在死后不同時(shí)間段的尸體傷口樣本中可以得到客觀的評(píng)價(jià)，那么CB2R將會(huì)為損傷時(shí)間推斷的實(shí)際應(yīng)用提供更有價(jià)值的信息。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同死后間隔時(shí)間CB2R表達(dá)變化規(guī)律，以探討死后CB2R的穩(wěn)定性以及在法醫(yī)學(xué)推斷損傷時(shí)間方面的可行性和可信度。Western blot和Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：死后3h，CB2R蛋白和mRNA表達(dá)量與生前傷相比仍無顯著性差異，受死后時(shí)間影響較小。死后6h，CB2R mRNA水平開始下降；死后12h，CB2R蛋白水平開始降低；但直至死后3d，CB2R蛋白和mRNA仍可以檢測(cè)出。研究結(jié)果揭示了CB2R蛋白和mRNA水平在個(gè)體死后的降解規(guī)律。

尸體中各種生物學(xué)物質(zhì)的蛋白或mRNA水平通常被用于推斷死亡時(shí)間。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，由于RNA酶的廣泛存在，mRNA和蛋白相比更加容易降解。然而，幾例觀察尸體樣本mRNA降解的研究卻得出了相反的結(jié)論。Johnson等報(bào)道了死后36h的尸檢，發(fā)現(xiàn)腦組織樣本的mRNA沒有發(fā)生實(shí)質(zhì)上的降解。Marchuk等報(bào)道了死后在室溫放置96h的兔組織樣本沒有發(fā)生顯著的mRNA或rRNA的減少。在推斷損傷時(shí)間方面，Bai等報(bào)道了在兔皮膚切創(chuàng)樣本中細(xì)胞因子IL-1β、COX-2、MCP-1的mRNA水平于死后6h依然沒有顯著下降；而Sun等發(fā)現(xiàn)在大鼠骨骼肌挫傷樣本中troponin I mRNA水平于死后0.5h即發(fā)生顯著的降解。本研究發(fā)現(xiàn)CB2R mRNA在死后6h開始發(fā)生降解，早于CB2R蛋白在死后開始發(fā)生降解的時(shí)間?？梢姡煌飳W(xué)物質(zhì)mRNA的降解在不同物種、不同模型、不同組織中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。因此，確定不同生物學(xué)物質(zhì)mRNA在人體死亡后的降解規(guī)律將是法醫(yī)學(xué)工作者今后必須面對(duì)和解決的問題之一?？傊?，本研究闡明了在小鼠皮膚損傷后不同死后間隔CB2R蛋白和mRNA降解的時(shí)間規(guī)律性，這為CB2R應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)際檢案工作中奠定了基礎(chǔ)。

1.StanderS，SchmelzM，MetzeD，etal.Distribution ofcannabinoid receptor 1(CB1)and 2(CB2)on sensorynerve fibersandadnexalstructureainhuman skin.JDermatolSci. 2005；38:177-188

2.Abood ME，Rizvi G，Sallapudi N，etal.ActivationoftheCB1cannabinoid receptor protectscultured mouse spinal neurons against excitotoxicity.Neurosci Lett.2001；309:197-201

3.Nagayama T，Sinor AD，Simon RP，etal.Cannabinoids and neuroprotection in global and focal cerebral ischemia and in neuronal cultures.J Neurosci.1999；19：2987-2995

4.Shen M， Thayer SA.Cannabinoid receptor agonist sprotect cultured rat hippocampal neurons from excitotoxicity.MolPharmacol.1998；54：459-462

5.Pryce G， Ahmed Z， Hankey DJ， etal.Cannabinoids inhibit neurodegeneration in models of multiplesclerosis.Brain.2003；126：2191-2202

6.MarsicanoG，Moosmann B，Hermann H，etal.Neuroprotective properties of cannabinoids against oxidative stress： role ofthe cannabinoid receptor CB1.J Neurochem.2002；80：448-456

7.Hampson AJ，Grimaldi M，Axelrod J，etal.Cannabidiol and(-)Delta9-tet rahydrocannabinol are neuro-protective antioxidants.Proc Natl Acad Sci USA.1998；95：8268-8273

8.El-RemessyAB，KhalilIE，MatragoonS，etal.Neu2roprotective effect of rahydrocannabinol and cannabidiol in N-methyl-D-aspartate-induced retinal neurotoxicity： involvementof peroxynitrite.Am J Pathol.2003；163：1997-2008