張凡凡，于 磊，魯為華，萬娟娟

(石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000)

線葉野豌豆(Viciatenuifolia)為多年生旱中生半攀援性根蘗型豆科植物，自然分布于新疆天山、阿爾泰山的中低山帶。該豆科牧草在自然狀態(tài)下株叢高、地上生物量大，并且品質優(yōu)良、莖枝細嫩、葉片柔軟、營養(yǎng)豐富、粗蛋白含量高、適口性佳，是各類家畜均喜食的一種優(yōu)質野生豆科牧草，有非常好的開發(fā)利用前景[1-2]。把線葉野豌豆引入綠洲區(qū)進行馴化的工作已開展數(shù)年，前人分別就其生物學特征[3]、栽培條件下的經(jīng)濟性狀[4]、施肥對其產(chǎn)草量的促進作用，以及種子生產(chǎn)[5]等進行了研究，初步認識和掌握了線葉野豌豆在綠洲區(qū)馴化過程中所表現(xiàn)的性狀特點，為馴化栽培種的培育創(chuàng)造了必要條件。本研究在上述工作的基礎上，對野生線葉野豌豆在綠洲區(qū)馴化過程中各馴化年限采收的種子及幼苗的理化性質加以分析，以揭示該豆科牧草在新環(huán)境下的適應性和變異性的特征，為馴化栽培種的培育提供科學依據(jù)和理論指導。

1 材料與方法

1.1試驗材料 試驗主要以各線葉野豌豆種子及其幼苗為研究對象。

種子分別為：采自裕民縣巴爾魯克山的野生線葉野豌豆原種(A)、馴化第1代生長第2年收獲的種子(B)、馴化第1代生長第3年(C)和生長第4年收獲的種子(D)。各采收種子均干燥到5%水分保藏在超低溫冰箱里(-80 ℃)。種子在使用前進行40 ℃的解凍[6]，以打破種子的休眠。

幼苗分別為各種子盆栽試驗種植30 d后取得，A種出的幼苗稱為野生線葉野豌豆原種的子代幼苗(A1)、B種出的幼苗稱為馴化第1代第2年收獲種的子代幼苗(B1)、C和D種出的幼苗分別稱為馴化第1代第3年收獲種的子代幼苗(C1)和馴化第1代第4年收獲種的子代幼苗(D1)。盆栽試驗方法：試驗前采用化學方法打破種子的硬實，即將各種子分別用濃硫酸進行15 min的浸種[7]，浸種處理后將各種子洗至中性，催芽后分別點播在塑料花盆中，挑選大小相似、發(fā)芽好的種子每盆種25粒，每類種子種15盆，共60盆；后統(tǒng)一放置于人工氣候箱中管理，晝/夜溫度25 ℃/15 ℃，光照時數(shù)12 h·d-1，平均每3～5 d澆一次水，期間澆水量、澆水方式及管理方式相同。盆栽試驗所用土壤采自石河子大學牧草試驗站，土壤為重壤；花盆為普通塑料花盆(上口徑20 cm，下口徑15 cm，高15 cm)。

1.2測定與分析方法

1.2.1線葉野豌豆種子特性變化測定 主要測定的項目為種子千粒重、種子硬實率、種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

種子千粒重：取各試樣8個重復，每個重復100粒，分別稱取8個重復的質量，并計算千粒重[7]。種子硬實率：將供試種子不做任何處理放置于種子培養(yǎng)箱內恒溫[(25±0.5)℃]發(fā)芽，各試樣取100粒，重復3次，待發(fā)芽結束后，仍未吸脹的種子作為硬實種子，統(tǒng)計其數(shù)量[7]。種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢：取各供試種子100粒分別用濃硫酸進行15 min的浸種，處理后將種子洗至中性，均勻的放置在墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，并放入發(fā)芽床中進行發(fā)芽[(25±0.5)℃]，重復3次，發(fā)芽期間保證充足的水分，按種子檢驗規(guī)程方法計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢[8]，但由于不同牧草種子末次計算發(fā)芽的天數(shù)相差很大，所以結合種子檢驗規(guī)程和此牧草發(fā)芽的規(guī)律，發(fā)芽試驗初期設定為3 d，并以每個處理發(fā)芽末期連續(xù)5 d發(fā)芽數(shù)不超過1%作為發(fā)芽結束。按照下列公式計算發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

發(fā)芽率=[發(fā)芽試驗末期全部正常發(fā)芽種子數(shù)/供檢種子數(shù)]×100%；

發(fā)芽勢=[發(fā)芽試驗初期(3 d)正常發(fā)芽種子數(shù)/供檢種子數(shù)]×100%。

1.2.2線葉野豌豆幼苗耐寒性變化測定 將A1、B1、C1、D1定苗后(保留植株大小、高度相似的材料)分別放置在20、15、10、5和0 ℃的人工氣候箱中，處理時間統(tǒng)一為2 h。處理后將各幼苗地上部分剪下進行生化指標的測定，重復3次。參考有關植物耐寒性研究的文獻[9-20]，并通過預試驗對供試幼苗的可溶性蛋白質、葉綠素、游離脯氨酸、可溶性糖及丙二醛的含量進行測定，通過預試驗發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白質(SP)、丙二醛(MDA)及可溶性糖(WSS)3個指標對線葉野豌豆耐寒性影響相對較大，故選取SP、MDA和WSS 3個生化指標作為線葉野豌豆耐寒性的主控因子。其中SP含量測定采用考馬斯亮藍G-250法[20]，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法[19]，WSS含量測定采用蒽酮比色法[20]。

1.2.3線葉野豌豆幼苗生長狀況測定 主要測定的項目為株高及生長速度。株高：盆栽試驗期內從不同馴化種的每盆線葉野豌豆中隨機選擇10株，用普通卷尺測量株高(精確到毫米)，算出10株株高的平均值。生長速度：相鄰兩次測定株高之差除以間隔生長時間。

1.2.4數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)記錄與作圖，DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1各馴化年限線葉野豌豆種子特性變化分析 試驗結果表明，線葉野豌豆種子隨馴化年代的延長，千粒重逐漸下降，千粒重排序依次為A>B>C>D。經(jīng)過馴化的線葉野豌豆隨馴化年限延長，硬實率逐漸降低，硬實率排序為A>B>C>D。隨馴化年限延長發(fā)芽率和發(fā)芽勢逐漸增高，排序為D>C>B>A，這表明馴化后的線葉野豌豆種子的硬實率、出苗的速度和整齊度均較野生種有顯著的提高(P<0.05)(表1)。

2.2各馴化年限線葉野豌豆幼苗生長變化分析 試驗結果表明，各供試線葉野豌豆幼苗在播種后0～15 d內生長變化明顯(P<0.05)，到20 d左右各供試幼苗生長均趨于平緩。隨著馴化年限的延長，A1、B1、C1幼苗日生長速度有所升高，而D1幼苗日生長速度顯著高于其他幼苗(P<0.05)，日生長速度排序為D1>C1>B1>A1(表2)。

2.3各馴化年限線葉野豌豆幼苗耐寒性變化分析

2.3.1低溫脅迫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗中可溶性蛋白(SP)含量變化規(guī)律 在10～20 ℃內幼苗A1、B1、C1、D1中SP的含量隨溫度的降低而降低，10 ℃ SP含量均下降到最低(P<0.05)，而10 ℃以下隨溫度的降低幼苗中SP含量較10 ℃又有所提高(P<0.05)，這表明各供試幼苗均在10 ℃左右開始受到低溫脅迫的影響，在0～10 ℃較敏感?？傮w來看，各供試幼苗SP含量在低溫脅迫期內均呈“U”型曲線變化(圖1)。各馴化種與原種對比SP的總積累含量均顯著降低(P<0.05)，在低溫脅迫期內幼苗中SP總積累含量排序依次為A1>B1>C1>D1(表3)。

表1 各馴化年限線葉野豌豆種子特性變化特征Table 1 The seed trait of Vicia tenuifolia in different growth year

表2 各馴化年限線葉野豌豆幼苗株高變化及日生長速度情況Table 2 Seedling height and daily growth rate of different Vicia tenuifolia accessions

2.3.2低溫脅迫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗中丙二醛(MDA)含量變化規(guī)律 幼苗A1,B1,C1,D1中MDA含量總體呈現(xiàn)“S”曲線變化，在整個脅迫溫度內MDA含量變化明顯，在10和15 ℃時出現(xiàn)兩個折點，10～20 ℃內MDA含量先上升后下降，10 ℃以下，隨溫度的降低MDA的含量較其它溫度下顯著升高(P<0.05)?？傮w變化趨勢表現(xiàn)為隨溫度降低MDA含量增高(圖2)，且不同馴化年限幼苗中MDA總積累含量存在差異(圖2)，各供試幼苗MDA總積累含量排序依次為D1>C1>B1>A1(圖2、表3)。

2.3.3低溫脅迫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗中可溶性糖(WSS)含量變化規(guī)律 幼苗A1,B1,C1,D1中WSS的含量變化規(guī)律同SP含量變化相似，10 ℃左右WSS含量下降到最低(P<0.05)，在0～5 ℃、10 ℃左右及15～20 ℃這3個溫度段WSS含量變化顯著(P<0.05)(圖3)。從試驗結果看，各試驗材料中WSS含量對溫度感受極敏感，在低溫脅迫條件下，線葉野豌豆幼苗中WSS總積累含量隨著馴化年限的延長呈下降趨勢(P>0.05)(表3)。

圖1 低溫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗可溶性蛋白的變化Fig.1 Seedling SP of different Vicia tenuifolia accessions under low temperatures

圖2 低溫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗丙二醛的變化Fig.2 Seedling MDA of different Vicia tenuifolia accessions under low temperature

2.4各馴化年限線葉野豌豆幼苗耐寒性變化綜合分析 變異系數(shù)大小可以反映各指標在脅迫溫度期間離散的程度，進而可以反映該牧草在脅迫溫度下各指標含量的變化程度[21-22]。綜合考慮各指標含量及變異系數(shù)兩方面，對各幼苗的耐寒性進行排序，可溶性蛋白、可溶性糖含量高且變化平緩，MDA含量低、變化平緩，耐寒性強(表3、表4)，耐寒性強弱排序結果為A1>B1>C1>D1。

3 討論

3.1馴化對線葉野豌豆種子特性特征及幼苗生長情況的影響 植物的馴化是一個繁瑣而又漫長的過程，經(jīng)過多年的馴化，植物的“野性”才會逐漸消失，但在長期的自然選擇過程中，植物在劣境下已有一套完整的保留機制，主要表現(xiàn)在種子休眠的存在，以延續(xù)種質[23-24]。而休眠的種子均存在較高的硬實率，發(fā)芽率低影響生產(chǎn)利用[25]，尤其是豆科牧草，由于其硬實率一般較高，限制了種子的萌發(fā)和出苗，造成種子萌發(fā)慢或不萌發(fā)，這就直接導致了出苗不齊或不出苗；另外，千粒重、發(fā)芽率和發(fā)芽勢幾個指標也可以很好地反映種子的飽滿程度以及發(fā)芽的速度和整齊度。本試驗中經(jīng)過綠洲區(qū)馴化后的野生線葉野豌豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢提高，而硬實率下降，這一結論與許多研究者的結果相同[23,26-27]，而馴化后的種子千粒重下降，這與偃麥草(Elytrigiarepen)的馴化規(guī)律有所不同[26]。植物幼苗的高度及生長快慢可以反映出植物生長形態(tài)的特征，也可以反映出植物后期的生長狀況，本試驗中經(jīng)過綠洲區(qū)馴化后的線葉野豌豆幼苗表現(xiàn)出隨年限的延長其生長速度加快的規(guī)律，這與賀海洋等[27]的研究是相同的。這些變化規(guī)律一方面取決于種子特性，另外可能還與綠洲區(qū)的高溫干燥氣候有密切關系。

圖3 低溫下各馴化年限線葉野豌豆幼苗可溶性糖的變化Fig.3 Seedling WSS of different Vicia tenuifolia accessions under low temperatures

表3 各馴化年限線葉野豌豆幼苗抗寒生理指標低溫脅迫溫度內總積累量變化Table 3 Seeding total accumulation of different Vicia tenuifolia accessions in three Physiological indices

表4 各馴化年限線葉野豌豆耐寒性指標脅迫期內變異系數(shù)Table 4 The variation coefficient of Vicia tenuifolia cold resistance index in different growth year %

3.2馴化對線葉野豌豆幼苗耐寒性的影響 選擇3個生理指標SP、MDA和WSS作為主控因子。其中，SP含量的變化可以很好地反映植物在受到低溫冷害時的變化規(guī)律[9-12]，隨著溫度的降低SP含量增加，以提高冰點，抵御低溫冷害[12-13]。在低溫冷害下SP含量的增加一方面是由于細胞膜或其他結合物質釋放出的蛋白質，另一方面有可能是由于低溫誘導產(chǎn)生了新的冷調節(jié)蛋白。MDA含量也是判斷植物耐寒性指標的一個重要標準，它是植物遭受逆境脅迫時生物膜系統(tǒng)膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，其濃度的高低代表膜脂過氧化強度及膜系統(tǒng)的傷害程度，直接關系到植物抗寒能力的強弱[13-16]。關于低溫馴化對膜脂過氧化作用的影響，以往的研究中大部分結論認為MDA含量與耐寒性呈負相關[15]，而本試驗各供試幼苗在15 ℃出現(xiàn)了一個峰值，隨著溫度的持續(xù)降低又有所下降，10 ℃左右下降到最低，10 ℃以下又繼續(xù)升高，原因可能為在15 ℃左右膜脂過氧化嚴重出現(xiàn)峰值，當脅迫溫度降低到10 ℃左右，各供試幼苗暫時適應了低溫環(huán)境，但隨著脅迫加重，各幼苗在短時間內不能適應新的低溫環(huán)境，所以MDA含量又有所升高。另外，10 ℃下，隨溫度降低，WSS含量提高，可能是因為低溫降低了細胞內水勢，增加保水能力，從而降低冰點，保持細胞不至遇冷凝固；同時，更易于植物細胞氧化供能，從而提高植物的抗寒能力[17-19]。

綜合低溫脅迫期內3個生理指標的總積累量可以作為判斷植物耐寒性的指標，但是這只是綜合評價的一個方面，另一方面，植物的耐寒性也與低溫脅迫期內各指標變化的程度有關。因此將各指標在低溫下的變化趨勢加以分析，可綜合評判出植物的耐寒性，本試驗中，耐寒性表現(xiàn)出隨馴化年限延長下降的規(guī)律，其原因可能是野生線葉野豌豆所處生境氣候濕潤冷涼，在長期的自然選擇過程中，野生線葉野豌豆的抗寒力一直處于“激發(fā)”狀態(tài)，而本研究選擇的馴化條件是在綠洲區(qū)環(huán)境下，其生態(tài)條件與原生境截然不同，所以抗寒力有所減弱，在今后的研究中可嘗試原生地馴化或分階段逐級馴化和過度馴化(即選擇與原生地氣候相似的地帶作為引種中轉站)[28]。另外，本試驗僅將自然選擇下培育出4個子代的種子和幼苗進行耐寒性對比分析得出結果，其種性及抗寒性的突變是否是由環(huán)境效應所引起的，其表現(xiàn)的優(yōu)良性狀是否能夠遺傳，還有待進一步的深入研究。

4 結論

在綠洲區(qū)栽培馴化條件下，野生線葉野豌豆為適應新的環(huán)境，改變了其生存策略，其種子性狀、幼苗的生長特征及耐寒性均發(fā)生了變異，隨著在綠洲區(qū)馴化年限的延長種子的千粒重和硬實率下降，發(fā)芽率和發(fā)芽勢提高；幼苗的生長速度加快，耐寒性下降。

目前，對于牧草引種馴化的成功與否，沒有統(tǒng)一的衡量標準，僅滿足了人們的某種特定目的就被認定為引種馴化成功，由此來看，可以選擇馴化種進行栽培和選育，并加以人工選擇的方式以得到更為優(yōu)良的牧草種質資源。

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