盛銘浩 徐鳳花 代歡 張晴

摘要：以腐木和堆肥樣品為材料，通過限制性繼代培養(yǎng)和混合培養(yǎng)，篩選出一組高效穩(wěn)定的低溫纖維素降解復合菌系Y。對復合菌系Y不同生長階段pH、酶活、失重率及產(chǎn)物之間的相互關系進行了研究。結(jié)果表明，0～6 d為復合菌系Y的對數(shù)生長期，4 d內(nèi)濾紙條完全崩解，在20 ℃下靜置培養(yǎng)10 d，水稻秸稈的降解率達到59%，酶活為103.5 U/mL，主要代謝產(chǎn)物為乙酸，并有少量的丁酸和丙酸，含量分別為1.70、0.21、0.12 g/L，其中乙酸占總揮發(fā)酸含量的85%。復合菌系Y適用于以秸稈為原料的低溫產(chǎn)沼氣發(fā)酵。

關鍵詞：低溫纖維素降解復合菌系；選育；水稻秸稈；代謝產(chǎn)物

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）08-1814-03

我國每年農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量高達7億多噸，除很少一部分得到利用外，大部分被堆積或焚燒，不僅浪費資源，還對環(huán)境造成污染[1]。利用微生物發(fā)酵技術將纖維素轉(zhuǎn)化為有機酸、醇、甲烷以及氫氣等化工原料和能源[2]，對解決當今所面臨的能源危機和環(huán)境污染問題具有重要的現(xiàn)實意義。

由于很多菌株不能產(chǎn)生全組分的纖維素酶，且所產(chǎn)酶的活性不高，常常依靠兩種或多種微生物共同培養(yǎng)完成，因此，復合菌系的作用逐漸得到重視[3-6]。目前，國內(nèi)外關于纖維素降解菌研究主要集中在單菌株的分離篩選、鑒定以及中高溫復合菌系的選育[7-9]，對低溫纖維素降解復合菌系的研究較少。因此，試驗通過限制性繼代培養(yǎng)，從3種不同樣品中馴化篩選復合菌系，并就其對纖維素的降解能力以及在培養(yǎng)過程中pH、酶活及產(chǎn)物的動態(tài)變化進行研究與分析，以期選育出一組高效穩(wěn)定的低溫纖維素降解復合菌系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 黑龍江北部山區(qū)腐木、東北農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室堆肥樣品及沼渣，樣品編號分別為YC、DF、ZZ。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體篩選培養(yǎng)基[8]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，粉碎水稻秸稈2 g，微量元素溶液0.5 mL，去離子水1 000 mL。

微量元素溶液成分（g/L）[9]：ZnSO4 0.29，CaCl2 0.24，CuSO4 0.25，MgSO4 0.17。

1.2 試驗方法

將3種樣品接入200 mL篩選培養(yǎng)基中，放入兩片濾紙條作為指示，20 ℃恒溫靜置培養(yǎng)。待濾紙條降解完全時，轉(zhuǎn)接于同樣的新鮮培養(yǎng)液中，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，篩選降解速度快且性能穩(wěn)定的樣品，并將其相互配合培養(yǎng)，直至篩選高效穩(wěn)定的復合菌系。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 纖維素失重率的測定 將培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液離心，去上清，然后用鹽酸和硝酸的混合液沖洗剩余物，以除去殘留的菌體和碳酸鈣，再用清水反復沖洗多次，最后置于烘箱中烘至恒重[3]。計算失重率。

1.3.2 纖維素酶活性測定 培養(yǎng)液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，DNS法[10]測定上清液Cx酶、C1酶和β-葡萄糖苷酶的活性。定義40 ℃反應條件下，1 min內(nèi)水解底物產(chǎn)生1 mmol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶量為一個酶活單位[11]。

1.3.3 生長曲線的制作 用250 mL的葡萄糖瓶裝入180 mL培養(yǎng)基，接入20 mL種子液，20 ℃靜置培養(yǎng)，每隔24 h取樣，用北京普析T6新世紀紫外可見光分光光度計測定600 nm處的吸光度，以未接菌的培養(yǎng)基作對照。

1.3.4 pH測定 采用上海偉業(yè)儀器廠pHS-3C型數(shù)字pH計進行測定。

1.3.5 培養(yǎng)液中有機酸含量測定 采用美國Agilent 6890N型氣相色譜對接菌10 d的培養(yǎng)液進行測定[12]。

1.3.6 水稻秸稈纖維組織電鏡觀察 將復合菌系Y以5%接種于篩選培養(yǎng)液（水稻秸稈未經(jīng)粉碎），同時以未接菌的培養(yǎng)液作為對照，培養(yǎng)7 d，在掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察水稻秸稈組織變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 復合菌系的馴化篩選結(jié)果

采用1.2的馴化篩選方法，樣品YC和DF培養(yǎng)物在20 ℃靜置培養(yǎng)條件下都有較強纖維素分解能力，將這兩種培養(yǎng)液混合，得到復合菌系Y，復合菌系Y在4 d內(nèi)可使濾紙條完全崩解，將Y、YC、DF 3種樣品繼續(xù)傳代馴化直到降解能力達到穩(wěn)定。經(jīng)過幾代培養(yǎng)之后復合菌系Y的酶活一直保持較高水平并且十分穩(wěn)定，第10天降解率可達到59%（圖1），總酶活達到103.5 U/mL（圖2）。

2.2 復合菌系Y生長曲線

從圖3可以看出，復合菌系Y沒有經(jīng)過延滯期就進入對數(shù)生長階段，原因可能是微生物經(jīng)過多代馴化，復合菌系Y自身形成了相對的生態(tài)穩(wěn)定性[13]，從而使其在極短的時間內(nèi)就適應了培養(yǎng)環(huán)境。微生物數(shù)量迅速增長并在第6天達到峰值，隨后逐漸下降，可能是因為復合菌系Y剛接入培養(yǎng)液時，營養(yǎng)成分充足，生長較快，但是隨著大量代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和營養(yǎng)成分的消耗，微生物的生長受到抑制，從而導致微生物數(shù)量下降。

2.3 復合菌系Y對水稻秸稈的降解效果

在SEM下觀察水稻秸稈表面，結(jié)果表明，未經(jīng)過處理的水稻秸稈纖維結(jié)構完整規(guī)則，纖維表面致密（圖4A），這種致密的結(jié)構影響了纖維素與酶的接觸，進而影響了纖維素的降解；經(jīng)復合菌系Y降解處理后的水稻秸稈纖維結(jié)構松散，表面組織被嚴重破壞（圖4B），說明復合菌系Y對水稻秸稈纖維組織有較強的破壞作用，提高了纖維素的降解效率。

2.4 水稻秸稈降解液pH和復合菌系Y所產(chǎn)酶總酶活的變化

pH能夠迅速下降到弱酸性，再恢復到弱堿性并保持穩(wěn)定的變化規(guī)律，是復合菌系具有正常分解能力的體現(xiàn)[14]。從圖5可以看出，pH首先出現(xiàn)一個緩慢的下降階段，第4天下降到7.0，之后逐漸上升，到第6天達7.4，之后再次下降，直至第9天降到最低值6.7，之后呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢。從圖6可以看出，總酶活變化大致呈正態(tài)分布曲線，在7～10 d達到并維持較高水平，最高值為103.5 U/mL，此后總酶活開始下降。

通過對pH和總酶活變化的對比分析，可以在一定程度上反映出復合菌系Y產(chǎn)酶變化規(guī)律：在0～4 d時pH下降至較低值7.0，總酶活開始上升，pH在第6天達較高值7.4后總酶活呈現(xiàn)快速下降的趨勢，pH在總酶活最高點附近達到最低點，可能是因為纖維素降解菌株在菌群中占據(jù)了主導地位，伴隨菌體的大量生長和產(chǎn)酶高峰的到來，纖維素快速轉(zhuǎn)化為糖類并在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了乙酸等代謝產(chǎn)物，從而導致pH出現(xiàn)明顯的下降。在總酶活達到最高時，原料逐步消耗，之后pH 穩(wěn)定上升，總酶活開始下降，原因可能是隨著纖維素的消耗，培養(yǎng)基中碳源匱乏導致菌體生長變緩進入衰退期，導致產(chǎn)酶下降，隨著菌體的大量死亡裂解，使pH升高。

2.5 水稻秸稈降解液中VFA的變化

在復合菌系Y的培養(yǎng)過程中，乙酸為降解的主要產(chǎn)物，其含量遠大于丙酸和丁酸。從圖7可以看出，從培養(yǎng)第1天開始，降解液中乙酸含量就開始持續(xù)升高，并在第10天達到峰值1.7 g/L，而揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）含量也達到2.0 g/L，10 d后VFA含量逐漸下降，這一變化趨勢與pH變化規(guī)律相吻合，也解釋了復合菌系Y中微生物數(shù)量從第10天開始迅速下降的原因。

3 結(jié)論

通過馴化篩選，3種復合菌系YC、DF、Y在20 ℃條件下靜置培養(yǎng)10 d水稻秸稈的降解率分別為45%、20%、59%，總酶活分別為70.0、66.0、103.5 U/mL。

復合菌系Y在20 ℃下具有較高活性，0～6 d內(nèi)菌系處于對數(shù)生長期，其主要代謝產(chǎn)物為乙酸、丙酸和丁酸，其中乙酸占85%。

復合菌系Y在20 ℃條件下具有較高的纖維素降解能力，有助于加速低溫條件下廢棄纖維素降解的研究開發(fā)，實現(xiàn)農(nóng)村廢棄纖維素無害化處理、資源化利用，其主要產(chǎn)物為乙酸，可為以秸稈為原料的低溫沼氣發(fā)酵提供前體物質(zhì)[14]，提高產(chǎn)沼氣的發(fā)酵降解效率。

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