何生

摘要：為掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效價(jià)，了解烏魯木齊市米東區(qū)雞群禽流感免疫抗體水平，對(duì)該地區(qū)不同雞場進(jìn)行了禽流感抗體檢測。結(jié)果表明，40只免疫雞，免疫抗體效價(jià)合格數(shù)33只，總合格率為82.5%。說明近幾年對(duì)高致病性禽流感采取的強(qiáng)制免疫措施達(dá)到了比較顯著的效果。

關(guān)鍵詞：禽流感；免疫；抗體效價(jià)；血凝試驗(yàn)；血凝抑制試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S855 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2013）07-0029-02

禽流感是由禽流感病毒引起的一種禽類（家禽和野禽）的烈性傳染病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）定為A類傳染病。禽流感病毒感染后，呈現(xiàn)出較嚴(yán)重的全身性、出血性、敗血性癥狀，死亡率較高。禽流感病毒不僅能引起禽類嚴(yán)重的疾病，而且對(duì)人類和哺乳類動(dòng)物也能造成感染。在世界各種家禽和野生禽類中，按照血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）表面抗原來區(qū)分，已發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種屬于許多不同抗原亞型的病毒。各種品種和不同日齡的禽類均可感染高致病性禽流感。該研究為掌握H5N1高致病性禽流感疫苗免疫效價(jià)，了解本地區(qū)雞群禽流感免疫抗體水平，對(duì)該地區(qū)雞場進(jìn)行了禽流感抗體檢測，并對(duì)不其檢測結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 40只雞由米東區(qū)鐵廠溝鎮(zhèn)大草灘村養(yǎng)禽場提供。

1.1.2 試劑 禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原，禽流感病毒H5亞型血凝 抑制試驗(yàn)陽性血清，1%雞紅細(xì)胞懸液。

1.1.3 儀器 96孔V型微量反應(yīng)板、臺(tái)式離心機(jī)，單道、多道微量可調(diào)移液器，吸嘴，微量振蕩器，加樣槽。

1.2 方法

1.2.1 血凝（HA）試驗(yàn) 在微量反應(yīng)板的1～12孔均加入0.025 mL的PBS，換滴頭，吸取0.025 mL病毒懸液加入第1孔混勻，從第1孔吸取0.025 mL病毒液加入第2孔，混勻后吸取0.025 mL加入第3孔，依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025 mL棄之，換滴頭，每孔再加入0.025 mL PBS。每孔均加入0.025 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液，充分混勻后加入。在微量振蕩器上振蕩2 min， 在25 ℃恒溫箱內(nèi)靜置40 min后觀察結(jié)果。

1.2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn) 在微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025 mL的PBS，，第12孔加入0.05 mL的PBS，吸取0.025 mL被檢血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025 mL于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025 mL棄去。1～11孔均加入含4 HAU混勻的病毒抗原液0.025 mL，室溫25 ℃靜置30 min。每孔加入0.025 mL體積分?jǐn)?shù)為1%的雞紅細(xì)胞懸液混勻，輕輕混勻，在室溫25 ℃靜置40 min，對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的鈕扣狀沉到孔底。滅活疫苗的免疫效果以抗體效價(jià)≥4log2時(shí)，判定為免疫效力良好；<4log2時(shí)，判定為免疫效力較低，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行免疫接種。

2 結(jié)果與分析

2.1 血凝（HA）試驗(yàn)結(jié)果

將反應(yīng)板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌，完全血凝的抗原或病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。本試驗(yàn)中抗原的血凝效價(jià)為1：128。

2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)結(jié)果

以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有當(dāng)抗原對(duì)照孔（第11孔），紅細(xì)胞對(duì)照孔（第12孔）陰性血清對(duì)照都成立時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果才有效。被檢測的40份雞血清樣品中，抗體監(jiān)測結(jié)果其抗體效價(jià)≥4log2的樣品有33份，合格率達(dá)82.5%。雞群經(jīng)過幾次接種免疫后，抗體保持了較高的水平，與反復(fù)免疫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和免疫記憶有關(guān)。

3 小結(jié)與討論

3.1 免疫效果影響因素

免疫抗體水平的高低與疫苗的質(zhì)量、保存管理、疫苗免疫劑量、免疫操作技術(shù)、營養(yǎng)狀況、母源抗體水平、遺傳因素等都有關(guān)。在免疫時(shí)應(yīng)嚴(yán)格把管好質(zhì)量，對(duì)保存不當(dāng)、過期和失效的疫苗堅(jiān)決廢棄。在接種疫苗時(shí)確保每只雞都能接種到一定劑量的疫苗及要嚴(yán)格遵守接種疫苗時(shí)所應(yīng)遵守的原則，接種后還要注意觀察雞群的反應(yīng)情況。

3.2 試驗(yàn)器材的選擇和使用

微量反應(yīng)板。單道和多道微量移液器，吸頭等都會(huì)影響HI試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。微量反應(yīng)板有U型和V型兩種，V型板產(chǎn)生的凝集圖像清晰，易于判定，因此一般使用V型板，最好是一次性96孔V型微量反應(yīng)板。單道、多道可調(diào)微量移液器在使用時(shí)需注意：一是吸取液體時(shí)一定要緩慢平穩(wěn)地松開拇指，絕不允許突然松開，以防容液吸取過快，沖入移液器內(nèi)腐蝕柱塞而造成漏氣；二是取樣時(shí)只需按到第一檔，停點(diǎn)排樣時(shí)需按到第二檔停才能徹底排出，以達(dá)到吸取的量準(zhǔn)確。吸頭的型號(hào)和規(guī)格需一致，否則會(huì)導(dǎo)致加樣量不一致。

3.3 緩沖液的配制

試驗(yàn)中使用的稀釋液的pH對(duì)本試驗(yàn)有影響。稀釋液的pH在5.8以下時(shí)，紅細(xì)胞易自凝；pH在7.8以上時(shí)，凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，而pH 7時(shí)紅細(xì)胞沉淀最充分，圖形清晰。此外，緩沖液對(duì)其他酸堿物質(zhì)具有一定的緩沖能力，有維持反應(yīng)體系pH的作用。使用pH 7.2的PBS比使用生理鹽水作稀釋液效果好。

3.4 血清稀釋時(shí)的混合程度

稀釋血清時(shí)混合不均勻，會(huì)使結(jié)果出現(xiàn)差異。用微量移液器吹打時(shí)，V型孔內(nèi)和吸頭內(nèi)都易產(chǎn)生氣泡，使得稀釋不充分，而且稍不小心，孔內(nèi)的液體就會(huì)濺出，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以稀釋血清時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生過多的氣泡及液體濺出。