俄軍 武發(fā)思 汪萬福 陳庚齡 趙林毅 賀東鵬 徐瑞紅

內(nèi)容摘要：本研究利用FA-I型便攜式空氣微生物采樣器和分子技術(shù)，對魏晉五號壁畫墓保存環(huán)境空氣中可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的濃度、粒徑分布、群落組成進(jìn)行了監(jiān)測和分析。結(jié)果表明：墓室內(nèi)外空氣中細(xì)菌、真菌微粒濃度差異極顯著。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，墓室內(nèi)外主要細(xì)菌類群組成相似，而真菌類群組成具有較大差異。放線菌、枝孢屬、青霉屬和鏈格孢屬等大量存在于墓室空氣中，成為威脅磚壁畫保存的重要污染源。墓室內(nèi)長期較高的相對濕度和較為封閉的保存環(huán)境，是引起小粒徑微生物增殖的關(guān)鍵因素。建議階段性地打開展覽廳大門，增加墓室內(nèi)外的空氣交流。

關(guān)鍵詞：魏晉墓；壁畫；空氣微生物；粒徑分布；文物保護(hù)

中圖分類號：K854.3；X83 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1000-4106（2013）06-0109-08

Monitoring and Research on Microbes in the Environment of the Wall Paintings

in No. 5 of the Wei and Jin Tombs

E Jun1 WU Fasi2，3，4，5 WANG Wanfu2，3，4，5 CHEN Gengling1

ZHAO Linyi2，3，4，5 HE Dongpeng2，3，4 XU Ruihong2，3，4

（1. Gansu Provincial Museum， Lanzhou， Gansu 730050； 2. National Research Center for Preservation of Ancient Wall Paintings and Earthen Sites， Dunhuang， Gansu 736200； 3. Key Scientific Research Base for Preservation of Ancient Wall Paintings （SACH）， Dunhuang， Gansu 736200； 4. Key Laboratory for Preservation of Ancient Wall Paintings and Earthen Sites in Gansu Province， Dunhuang， Gansu 736200；

5. Preservation Institute， Dunhuang Academy， Dunhuang， Gansu 736200）

Abstract： This paper introduces the monitoring and analysis of concentration， size， distribution， and community structures of the bacteria and fungi cultivable in the air of the environment of the wall paintings on the Wei and Jin tomb bricks with a portable airborne microbe sampler （FA-I） and molecular technology. As the research results indicate， the concentrations of the bacteria and fungi in the air inside and outside the tomb are extremely different. The molecular identification and phylogenetic analysis show that the community structures of the fungi inside and outside the tombs are similar， but the concentrations of the bacteria and fungi particles are very different. Actinomycetes， cladosporium， pinicielium， and alternaria exist in the tomb air in large number， and become an important pollution source threatening the preservation of brick paintings. The long-time higher relative humidity and closed environment of the tombs are key elements that cause the proliferation of fine-size microbe particles. Therefore， we suggest that the gate of the exhibition hall be opened periodically to increase air changes of the tombs.

Keywords： Tombs of Wei and Jin dynasties； Wall paintings on mural bricks； Microbes in the air； Size distribution； Preservation of cultural relics

（Translated by WANG Pingxian）

一 引 言

當(dāng)前，對于文物保護(hù)的理念，已經(jīng)從單純的文物本身保護(hù)轉(zhuǎn)變?yōu)閷ξ奈锛捌浔４姝h(huán)境的預(yù)防性綜合保護(hù)。影響文物保存的環(huán)境因子主要包括水分、溫度、光照、大氣以及生物因子，它們可獨(dú)立或協(xié)同作用于文物，加速文物毀壞程度。就大氣環(huán)境而言，氣溶膠中大量的粉塵、有機(jī)分子和微生物孢子等多種成分，均會對文物構(gòu)成潛在的威脅，如空氣中飄浮的微生物孢子可以沉降在文物表面，當(dāng)材料基質(zhì)特征與周圍環(huán)境中的溫度與相對濕度滿足沉積孢子體生長的營養(yǎng)和生態(tài)需求時，它們即可在文物上滋生、擴(kuò)散，造成文物結(jié)構(gòu)特征和美學(xué)價值的破壞[1-2]。

為了評估大氣中的微生物成分，以及這些成分所引起歷史遺址或考古文物材料破壞的危險性，在文物保護(hù)中對于遺址所在環(huán)境中空氣微生物的監(jiān)測顯得尤為必要。國際空氣生物學(xué)監(jiān)測組織近期已將空氣中可培養(yǎng)微生物數(shù)量（Clone Forming Unit， CFU）的監(jiān)測列為文化遺產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測的重要部分，其可以作為洞穴及墓室中微生物爆發(fā)的早期預(yù)測與環(huán)境控制的生態(tài)指標(biāo)[3-4]。近年來，隨著大氣顆粒物采集技術(shù)和微生物鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展，對于洞穴、石窟寺和博物館等文物保存環(huán)境中空氣微生物的孢子含量、種類組成及其影響因素研究的報道也逐漸增多，所取得的研究成果為文物保存環(huán)境的安全性和空氣質(zhì)量評價提供了重要的參考依據(jù)[5-8]。

本研究以甘肅省博物館館藏魏晉五號壁畫墓保存環(huán)境中空氣微生物為監(jiān)測對象，利用便攜式FA-I型空氣微生物采樣器，通過基于培養(yǎng)和分子鑒定的技術(shù)手段，對墓室內(nèi)外空氣中可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的濃度、粒徑分布和群落組成進(jìn)行了統(tǒng)計與分析，旨在為磚壁畫保存環(huán)境空氣質(zhì)量的判定提供依據(jù)，并為墓室磚壁畫的后期保護(hù)提供建議。

二 材料與方法

（一） 樣點(diǎn)簡介

魏晉五號墓原址位于嘉峪關(guān)市東北 20 公里處的新城鄉(xiāng)戈壁灘上，始掘于1972 年，為雙室墓，總長7米左右。該墓葬于1973年完成考古發(fā)掘后即從嘉峪關(guān)整體搬遷至甘肅省博物館進(jìn)行異地保護(hù)，現(xiàn)為半地下式復(fù)原建筑，墓門外為斜坡式墓道，坡頂為陳列廳大門。墓室現(xiàn)對游客開放。墓室內(nèi)畫像磚除軍事題材外，系統(tǒng)、真實(shí)地再現(xiàn)了魏晉時期當(dāng)?shù)匕傩瞻敫肽恋慕?jīng)濟(jì)生產(chǎn)和日常生活情景[9]，為研究河西地區(qū)的政治、經(jīng)濟(jì)、軍事、文化、民族融合、生活方式、氣候等提供了可靠的實(shí)物依據(jù)。

前期現(xiàn)狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，磚壁畫顏料層多處產(chǎn)生起甲、酥堿甚至剝落，部分磚壁畫發(fā)生顏料變色，壁畫表面存在微生物菌斑等多種病害（圖1）。

（二） 樣品采集

五號墓墓室內(nèi)外環(huán)境中空氣微生物實(shí)驗(yàn)樣品，于2011年4月13日使用便攜式FA-I型空氣采樣器進(jìn)行采集。此型空氣采樣器是模擬人呼吸道的解剖結(jié)構(gòu)和空氣動力學(xué)特征，采用慣性撞擊原理設(shè)計制造。采樣器分為6級，每級400孔，從Ⅰ—Ⅵ級孔徑逐漸變小，空氣流速逐次增大，從而把空氣中的帶菌粒子按大小不同分別捕獲在各級培養(yǎng)皿上。在每個采樣點(diǎn)，采樣器架設(shè)在距離地面1.5 m高的三腳架上。采樣時空氣流量為28.3 L/min，時間設(shè)定為3 min。采樣器各層孔眼至采樣面的距離（即撞擊距離）為2 mm。每次取樣均設(shè)立三個重復(fù)。采樣過程中每次更換培養(yǎng)基時，均采用75%的酒精對采樣器進(jìn)行表面消毒處理，以減少樣品污染。

（三）實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中采用R2A培養(yǎng)基培養(yǎng)空氣中的細(xì)菌微粒，馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)真菌微粒。本實(shí)驗(yàn)選擇90 mm一次性無菌培養(yǎng)皿用于培養(yǎng)基的制備。培養(yǎng)基滅菌后在無菌條件下進(jìn)行25 ml /皿的分裝。培養(yǎng)基配制好后，經(jīng)過48h空培養(yǎng)（37℃）以確定無污染后才可用于采樣。

（四） 統(tǒng)計與分析

所有采集樣品放至恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)：細(xì)菌，37℃培養(yǎng)2—3天；真菌，25℃培養(yǎng)3—5天。根據(jù)采樣器各級采樣皿上菌落的克隆形成單位（Clone Forming Unit，CFU）記數(shù)，并經(jīng)換算和公式校正，得到每立方米空氣中細(xì)菌和真菌微粒的濃度[5]309-315。

通過對培養(yǎng)得到不同形態(tài)的菌落分離純化，完成單菌落基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增。細(xì)菌樣品以通用引物27F/1492R、真菌樣品以引物ITS1/ITS4擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，完成擴(kuò)增片段的分子克隆和測序。所得序列在基因數(shù)據(jù)庫GenBank中完成BLAST比對，用MEGA 4.0（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）中的雙參數(shù)模型計算遺傳距離，以鄰接法（Neighbor-joining）、最大簡約法和最小進(jìn)化法推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，并將所測序列及與其相似序列進(jìn)行遺傳關(guān)系研究和群落組成分析。

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2007和SPSS19.0進(jìn)行編輯，兩組數(shù)據(jù)間差異比較采用配對樣本T檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較經(jīng)LSD檢驗(yàn)后進(jìn)行一維方差分析（ANOVA）。

三 結(jié)果與分析

（一）墓室內(nèi)外可培養(yǎng)微生物數(shù)量分析

通過計算和統(tǒng)計分析，可以確定采樣時五號墓墓室內(nèi)外空氣中，可培養(yǎng)細(xì)菌濃度分別為1091±99 CFU/m3、868±14 CFU/m3。墓室內(nèi)空氣中細(xì)菌孢子濃度，高于外部環(huán)境大氣中濃度。但配對T檢驗(yàn)分析后發(fā)現(xiàn)，二者間差異并不顯著（P =0.127>0.05）。

魏晉五號墓墓室內(nèi)、外環(huán)境空氣中，可培養(yǎng)空氣真菌濃度分別為675±39 CFU/m3、448±27 CFU/m3。墓室內(nèi)空氣中真菌孢子濃度，明顯高于外部大氣環(huán)境中濃度。配對T檢驗(yàn)分析顯示，二者間差異極顯著（P =0.01>0.008）。

（二）墓室內(nèi)外可培養(yǎng)微生物粒徑分布

墓室內(nèi)外環(huán)境空氣中，可培養(yǎng)細(xì)菌在采樣器各級上所占的比例存在較大差異（圖2）。采樣器第六級（孔徑0.65—1.1μm）所占濃度百分比很低（<5%），表明該采樣器可以實(shí)現(xiàn)對空氣中細(xì)菌微粒的最大限度捕獲。墓室空氣中的細(xì)菌微粒主要分布在第三級（3.3—4.7μm）、第四級（2.0—3.5μm）和第五級（1.0—2.0μm），相當(dāng)于總檢測濃度的74.8%。其中第四級捕獲到的微粒最高，達(dá)到總濃度的35.9%，與其他各級間存在極顯著差異（P<0.01）。而在墓室外，細(xì)菌微粒主要分布在第一級（>7μm）、第三級和第四級，相當(dāng)于總檢測濃度的80.4%，其中第一級占到了總檢測濃度的35.7%。并且，墓室內(nèi)第四級與墓室外第一級間存在顯著差異（P=0.03<0.05）。

墓室內(nèi)外可培養(yǎng)真菌在采樣器各級上所占的比例也不同（圖3）。墓室空氣中的真菌微粒主要分布在第三級、第四級和第五級，相當(dāng)于總檢測濃度的83.2%。其中第四級捕獲的微粒最多，達(dá)到總濃度的50.6%，與其他各級間存在極顯著的差異（P<0.01）。而墓室外環(huán)境空氣中的真菌微粒主要分布在第二級（4.7—7μm）、第三級和第四級，相當(dāng)于總檢測濃度的76.2%。其中最高值出現(xiàn)在第四級，占到了總檢測濃度的35.1%，與其他各級間差異顯著（P<0.05）。

（三） 可培養(yǎng)微生物系統(tǒng)發(fā)生分析

墓室內(nèi)、外空氣中共分離純化得到細(xì)菌菌株20個，分子鑒定顯示，其隸屬于3門9屬。其中放線菌門（Actinobacteria）菌株數(shù)量最多，厚壁菌門（Firmicutes）次之，變形菌門（Proteobacteria）最少（圖4）。BM-G6為墓室內(nèi)空氣中特有菌株，其隸屬于動性球菌屬（Planococcus）。棒形桿菌屬（Clavibacter）、短小桿菌屬（Curtobacterium）、壤球菌屬（Agrococcus）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、肉食桿菌屬（Camobacterium）、動性桿菌屬（Planomicrobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）在墓室內(nèi)外均同時出現(xiàn)，表明兩個采樣點(diǎn)間細(xì)菌群落組成相似。

墓室內(nèi)、外空氣中共分離純化得到真菌菌株20個，分子鑒定顯示隸屬于2門9屬。其中子囊菌門（Ascomycota）菌株數(shù)量最多（15株），擔(dān)子菌門（Basidiomycota）次之（圖5）。墓室內(nèi)外空氣中真菌群落組成具有較大差異。FM-G1、FM-E1、FM-H4為墓室空氣中特有菌株，其主要隸屬于鏈格孢屬（Alternaria）和青霉屬（Penicillium）。FA-8H、FA-L5、FA-8G為墓室外空氣中特有菌株，其主要隸屬于鎖擲酵母屬（Sporidiobolus）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和匍柄霉屬（Stemphylium）。Davidiella、枝孢屬（Cladosporium）和隱球菌屬（Cryptococcus）為共有屬，其中枝孢屬為共有優(yōu)勢屬。

四 討 論

（一） 可培養(yǎng)微生物濃度

墓室內(nèi)空氣中微生物濃度整體高于墓室外環(huán)境，二者間細(xì)菌孢子濃度差異不顯著，而真菌孢子濃度差異極顯著。已有環(huán)境監(jiān)測研究表明，該墓室內(nèi)相對濕度在春、夏、秋季一直維持在70%—85%之間[10]。同時，墓室前室西壁存在一定程度的地下水滲漏，較高的相對濕度成為微生物增殖的前提條件。另外，墓室展覽廳大門長期關(guān)閉，墓室內(nèi)外空氣交換緩慢。在這些因素的共同作用下，造成墓室內(nèi)部空氣微生物濃度高于外部。

根據(jù)我國室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[11]，公共場合室內(nèi)空氣中細(xì)菌濃度不得超過2500 CFU/m3，五號墓磚壁畫保存環(huán)境中空氣微生物濃度尚在國標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)。然而，根據(jù)最新的洞穴環(huán)境生態(tài)干擾分級標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)具有巖畫的洞穴空氣中真菌濃度達(dá)到500—1000 CFU/m3時，表明游客參觀等外部因素已經(jīng)影響到了洞穴環(huán)境的穩(wěn)定性[4]1594-1598。與本研究比較而言，敦煌莫高窟洞窟內(nèi)外真菌濃度分別為190—300 CFU/m3、170—310 CFU/m3，微生物濃度在窟內(nèi)高于窟外，游客活動及相對封閉的內(nèi)部環(huán)境容易造成洞窟內(nèi)微生物孢子體的富集[5]309-315[6]461，466。其他研究表明，在參觀人數(shù)為400人/h的情況下，世博會展館內(nèi)微生物氣溶膠產(chǎn)生量達(dá)到44，000 CFU/h·m3 [12]。人體表皮的脫落、代謝、排泄物及所攜帶的微生物都會成為氣溶膠中微生物的污染源，正常人在靜止?fàn)顟B(tài)下平均每分鐘可向環(huán)境散發(fā)50—1500個菌粒，活動時排放菌粒多達(dá)數(shù)千至數(shù)萬，呼吸和說話都會向周圍環(huán)境中排放大量的微生物[13]。本研究中，五號墓墓室內(nèi)空氣中真菌濃度已達(dá)到675±39 CFU/m3，表明環(huán)境的穩(wěn)定性已經(jīng)受到了較大程度的影響，因此建議博物館管理人員采取間歇性通風(fēng)透氣等措施以增加墓室內(nèi)外的空氣交換，稀釋墓室內(nèi)空氣微生物濃度。

研究發(fā)現(xiàn)，空氣微生物受外環(huán)境因素影響較大，同時會呈現(xiàn)出明顯的時空動態(tài)變化特征，通過檢測空氣微生物可以確定環(huán)境氣溶膠中微生物的污染源，對于保護(hù)文物及其附存環(huán)境具有重要作用[14]。因此，有必要建立遺產(chǎn)地及博物館環(huán)境中微生物的時空動態(tài)監(jiān)測體系，以確定不同時間段和游客參觀對文物保存環(huán)境中空氣微生物濃度和群落結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)而為旅游開放和文物保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

（二）可培養(yǎng)微生物粒徑

空氣微生物在采樣器各級上的捕獲情況，可以反映出空氣的質(zhì)量狀況。墓室內(nèi)環(huán)境中，采樣器第四級捕獲到了較多的細(xì)菌微粒，表明墓室內(nèi)多數(shù)攜帶細(xì)菌孢子的微粒都較?。欢谝患壊蓸悠髟谀故彝獠东@到了較多的細(xì)菌微粒，這與當(dāng)?shù)爻鞘锌諝赓|(zhì)量較差、污染顆粒物較大較多存在一定的關(guān)聯(lián)。如在北京外交通干線環(huán)境空氣中的細(xì)菌粒子主要分布在采樣器前4級（>2μm）中，最高值高峰分布在第一級（>8.2μm）中[15]。細(xì)菌微粒大多吸附于塵埃粒子表面，由于重力的作用，較大的粒子易沉降于近地面。

墓室空氣中的真菌微粒主要分布在采樣器的第二—四級，其中最高值出現(xiàn)在采樣器的第四級。與之相似，莫高窟空氣中真菌微粒主要分布在采樣器的第二—四級[6]461-466 [16]。墓室內(nèi)外主要真菌微粒的分布范圍差異較小，ANOVA分析顯示，除第四級（P=0.00<0.01）外，其他各級之間差異均不顯著（P>0.05）。由此可知，造成墓室內(nèi)濃度增加的真菌微粒較小，主要分布在采樣器第四級。在外環(huán)境中真菌濃度較低的情況下，所增加的真菌微粒是粒徑較小的真菌孢子在墓室內(nèi)長期增殖的結(jié)果。

（三） 可培養(yǎng)微生物群落組成

本研究中，墓室內(nèi)外空氣中分離純化得到的放線菌門類群數(shù)量最多。有報道稱，在地下洞穴、墓室或石窟環(huán)境中，壁畫首先會遭受到鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬等放線菌家族成員的腐蝕，它們成為微生物在壁畫表面繁殖的先鋒種群[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，在莫高窟洞窟空氣內(nèi)也分離得到了大量的放線菌門節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）菌株[18]。其次，墓室內(nèi)空氣中特有細(xì)菌主要隸屬于動性球菌屬，特有真菌主要隸屬于鏈格孢屬和青霉屬。事實(shí)上，鏈格孢屬和青霉屬也是微生物污染壁畫上分離得到最多的真菌類群[19]。五號墓墓室空氣中極其豐富的放線菌、青霉、鏈格孢菌等已成為磚壁畫發(fā)生微生物腐蝕的重要污染源。

枝孢屬為五號墓墓室內(nèi)外空氣中的優(yōu)勢屬。有調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其在莫高窟洞窟內(nèi)外空氣中同樣占據(jù)著相對優(yōu)勢[16]13-18。已有研究表明，枝孢霉對壁畫制作材料骨膠具有較強(qiáng)的降解作用，可以促進(jìn)鉛丹向鉛白的轉(zhuǎn)化[20]。因此，有必要階段性地打開墓室展覽廳大門，控制磚壁畫保存環(huán)境中溫、濕度，避免墓室內(nèi)空氣中懸浮的放線菌和枝孢霉等有害微生物孢子因適宜的溫、濕度而在磚壁畫表面滋生、蔓延，造成磚壁畫變色和破壞。

五 結(jié)論及建議

通過對魏晉五號墓磚壁畫保存環(huán)境空氣微生物濃度、粒徑分布和群落組成的分析，主要得到以下結(jié)論：

1. 五號墓墓室內(nèi)可培養(yǎng)空氣微生物濃度高于墓室外部，其中真菌微粒濃度差異極顯著。

2. 細(xì)菌微粒在墓室內(nèi)主要分布在粒徑1.0—4.7μm，在墓室外主要分布在粒徑>7μm與2—4.7μm的范圍內(nèi)；而真菌微粒在墓室內(nèi)外均大量分布在粒徑2.0—4.7μm的范圍內(nèi)。

3. 墓室內(nèi)外可培養(yǎng)細(xì)菌群落組成相似，可培養(yǎng)真菌群落組成差異較大。墓室空氣中極其豐富的放線菌、枝孢屬、青霉屬、鏈格孢屬成員等已成為磚壁畫發(fā)生微生物破壞的危險污染源。

4. 空氣微生物的監(jiān)測在墓室微生物爆發(fā)的早期預(yù)測方面具有重要的指示作用。

綜上，墓室內(nèi)長期較高的相對濕度和較為封閉的保存環(huán)境是造成小粒徑細(xì)菌和真菌微粒增殖的關(guān)鍵因素。建議控制參觀游客流量和滯留時間，同時在天氣晴好干燥時，階段性地打開展覽廳大門，保證墓室內(nèi)外的空氣交流，避免有害空氣微生物孢子大量增殖后危害到磚壁畫的安全保存。

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