郭守軍 楊永利 黃惠萍 陳劍委 劉浩元

GUO Shou-jun YANG Yong-li HUANG Hui-ping CHEN Jian-wei LIU Hao-yuan

（韓山師范學(xué)院生物系，廣東 潮州 521021）

(Biology Departmentof Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong 521021,China)

烏欖(Canarium pimela koenig)，又名黑欖、木威子，是橄欖科橄欖屬的常綠喬木[1]，常生于低海拔的山地、林中。主要分布于中國廣東、福建、臺(tái)灣、海南、廣西、云南等省[2]，花期5～7月,果期8月。果核卵圓形至橢圓形,兩端鈍，成熟時(shí)紫黑色，有濃郁的香味。果實(shí)可食用，為嶺南果品之一，味酸、澀、性平、無毒，也是粵東名菜“橄欖菜”的輔料；種子即“欖仁”，是制糕餅的高級餡料之一，廣式中秋月餅中的“五仁”，其中便有它的一份，也可榨油食用[1-3]。烏欖果實(shí)含豐富的芳香成分，揮發(fā)油得率為0.111%，為黃色透明油狀液體，具有清甜的蜜蠟香氣，是制備食用香精的良好原料[4]。烏欖果具有清熱解毒、消腫止痛、治感冒、上呼吸道炎、肺炎、多發(fā)性癤腫等多種功效[5]；現(xiàn)代藥理學(xué)研究[6]表明，烏欖果的水提取物具有快速、顯著的降壓作用。烏欖果實(shí)中含有豐富的鈉、鈣、鎂、鐵、錳、鉬等人體必需的元素及較為豐富的V。果皮含有花青素[8]，是一種穩(wěn)定、安全的食用天然紫色素。

粵東是烏欖的主產(chǎn)區(qū)，普寧、揭西、潮州等地有大面積的種植，年產(chǎn)量約在5 000 t以上，資源豐富。但是烏欖果實(shí)在當(dāng)?shù)匾矁H作為腌制咸菜的輔料，果肉被食用后，果殼連同果仁常常被廢棄，造成了很大的浪費(fèi)。目前也未見有關(guān)烏欖種仁油提取工藝及其性質(zhì)等方面的研究報(bào)道。本試驗(yàn)以烏欖果仁為原料，利用有機(jī)溶劑萃取法并借助正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)提取烏欖種仁油，測定其理化性質(zhì)，并通過GC—MS分析了烏欖種仁油中脂肪酸成分，以期對烏欖果的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮烏欖果實(shí)：廣東省揭陽市揭西縣烏欖園；

無水乙醇、丙酮、正己烷、環(huán)己烷、石油醚（30～60 ℃）、三氯甲烷、無水硫酸鈉、正庚烷、甲醇、氫氧化鉀、鹽酸、冰乙酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

一氯化碘、碘化鉀、可溶性淀粉、酚酞指示劑：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：JJ1000型，常熟雙杰測試儀器廠；

氣相色譜—質(zhì)譜—計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀：HP 6890／5973型，美國Hewlett-Packark公司；

紅外線干燥箱：404-1型，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

阿貝折射儀：2WAJ型，上海宙山精密光學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

鮮果→去果皮和種皮→烏欖種仁→真空干燥（30℃，0.01 MPa）→粉碎（過80目篩）→索氏提取→無水硫酸鈉脫水→減壓濃縮→籽油

1.2.2 種仁的制備 將新鮮烏欖果實(shí)去果皮和種皮，將種仁于真空干燥箱中35℃干燥24 h，粉碎備用。

1.2.3 烏欖種仁油最佳提取工藝的研究

(1)提取試劑的選擇：稱取烏欖種仁粉 5.00 g，分別以單次虹吸溶劑量（料液比1∶18，m∶V）的無水乙醇、丙酮、正己烷、石油醚、三氯甲烷，在各自的最佳提取溫度下回流提取3 h，計(jì)算得油率，確定最佳的提取試劑。

(2)提取時(shí)間對得油率的影響：稱取5份烏欖種仁樣品各5.00 g，以石油醚為提取溶劑，分別置于索氏提取器中，加入兩次虹吸的量（料液比1∶18，m∶V）的最佳提取溶劑，55℃下分別回流提取 1，2，3，4，5 h，計(jì)算得油率，確定最佳的提取時(shí)間。

(3)提取溫度對得油率的影響：稱取5份烏欖種仁樣品各5.00 g，分別置于索氏提取器中，加入兩次虹吸的量（料液比1∶18，m∶V）的最佳提取溶劑，分別在 40，45，50，55，60℃下回流提取最佳提取時(shí)間長，計(jì)算得油率，確定最佳的提取溫度。

(4)料液比對得油率的影響：稱取5份烏欖種仁樣品各5.00 g，分別置于索氏提取器中，分別按 1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20(m∶V)的料液比加入最佳提取溶劑，在最佳提取溫度下回流提取最佳提取時(shí)間長，計(jì)算得油率，確定最佳提取料液比。

(5)最佳提取條件的確定：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上以提取溫度、料液比和提取時(shí)間為三因素進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，確定烏欖種仁油的最佳提取工藝[9,10]。

1.2.4 得油率的測定 分別用質(zhì)量法和瓶重法計(jì)算得油率[11]，并取二者平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

(1)質(zhì)量法：得油率的計(jì)算公式見式(1)。

式中：

R——得油率，%；

mA——提取前樣品加濾紙的質(zhì)量，g；

mB——提取后樣品加濾紙的質(zhì)量，g；

m1——提取前樣品質(zhì)量，g。

(2)瓶重法：得油率的計(jì)算公式見式(2)。

式中：

R——得油率，%；

m'——提取前空圓底燒瓶的質(zhì)量，g；

m''——提取后圓底燒瓶加樣品油的質(zhì)量，g；

m1——提取前樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 GC—MS分析

(1)甲酯化：取1 g油樣于圓底燒瓶中，移取10mL甲醇及0.125mL 1mol/L KOH甲醇溶液于油樣中，并加入幾粒沸石，加熱回流至溶液清澈透明為止（回流過程不斷搖動(dòng)燒瓶）。冷卻后，將燒瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并用5mL正庚烷洗滌燒瓶，將此洗滌液一并轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，并向分液漏斗中加入10 mL蒸餾水，搖動(dòng)，靜置分層（上層為酯層，下層為水層）后，分出上層液，下層溶液繼續(xù)再用5 mL正庚烷重復(fù)萃取1次，合并上層溶液，并用蒸餾水進(jìn)行多次洗滌，直至洗滌水呈中性為止，分離出酯層，無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓濃縮，回收溶劑，得到約5 mL的脂肪酸甲酯的正庚烷溶液裝入樣品瓶中，用封口鉗封口置入4℃冰箱，進(jìn)行GC—MS分析。

(2)氣相色譜條件：石英毛細(xì)管柱 HP-5MS，30μm×0.25μm，膜厚0.25μm。程序升溫：從60℃開始，保持1min，以2.5℃／min升到210℃，保持5min，再以10℃／min升到280℃，保持 10 min；進(jìn)樣量 0.4μL，分流比 1∶60；載氣為He，柱流量 1.2mL／min，進(jìn)樣口溫度：280 ℃。

(3)質(zhì)譜條件：EI源；電離電壓70 eV；離子源溫度230℃；掃描范圍 33～550 AMU，質(zhì)譜庫 NIST62.i和 ETANIH。

1.2.6 物化性質(zhì)的測定

(1)相對密度：按GB/T 5526——85（比重瓶法）執(zhí)行。

(2)折光指數(shù)：按GB/T 5527——85執(zhí)行。

(3)酸價(jià)：按GB/T 5530——1998執(zhí)行。

(4)碘值：按GB/T 5532——2008執(zhí)行。

(5)皂化價(jià)：按GB/T 5533——85執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏欖種仁油最佳提取工藝

2.1.1 最佳溶劑的選擇 提取溶劑對烏欖種仁油提取率的影響見圖1。

圖1 溶劑對種仁油提取率的影響Figure 1 Effectof solventon the extraction rate of Canarium pimela kernel oil

由圖1可知，提取溶劑的選擇對烏欖種仁油的提取率有較大的影響。無水乙醇浸提效果最差；丙酮、三氯甲烷、正己烷和石油醚都有較好的提取效果，但丙酮不適宜作浸提溶劑[11]，而三氯甲烷又有一定的毒性，所以前兩種溶劑在實(shí)際生產(chǎn)中無法應(yīng)用。后兩種中，石油醚提取率最高且得到油樣顏色較淺，散發(fā)出一股淡淡的油香味。因此，綜合考慮，選擇石油醚為烏欖種仁油的最佳提取溶劑。

2.1.2 提取時(shí)間對提取效果的影響 提取時(shí)間對烏欖種仁油提取率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對種仁油提取率的影響Figure 2 Effectof extraction time on the extraction rate of Canarium pimela kernel oil

由圖2可知，在進(jìn)行籽油提取的前4 h里，得油率隨提取時(shí)間的延長逐漸增大，當(dāng)提取時(shí)間為4 h時(shí)，得油率達(dá)到最大，但是當(dāng)提取時(shí)間超過4 h時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長得油率稍有下降。分析認(rèn)為，提取時(shí)間為5 h和6 h時(shí)提取率基本持平，提取時(shí)間為4 h得油率稍高于5 h和6 h，可能是由于微量提取溶劑殘留造成。綜合考慮各方面因素，選擇4 h為最佳浸提時(shí)間。

2.1.3 提取溫度對提取效果的影響 提取溫度對烏欖種仁油提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對烏欖種仁油提取率的影響Figure 3 Effectof temperature on the extraction rate of Canarium pimela kernel oil

由圖3可知，在50～55℃時(shí)，烏欖種仁的出油率隨提取溫度的上升而顯著升高。當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，得油率卻呈下降趨勢，其原因是所用提取劑石油醚的沸程為30～60℃，當(dāng)提取溫度超過55℃甚至高于60℃時(shí)，導(dǎo)致索氏提取器中石油醚的虹吸速度遠(yuǎn)超過了烏欖種仁中的油脂的溶出速度，在固定的提取時(shí)間內(nèi)，出油率反而略有降低。綜合考慮各方面因素，選擇55℃為最佳浸提溫度。

2.1.4 料液比對提取效果的影響 料液比對烏欖種仁油提取率的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)料液比從1∶12(m∶V)增至1∶16(m∶V)時(shí)，烏欖種仁的出油率逐漸升高，而在料液比1∶16(m∶V)以后烏欖種仁的出油率略有降低。料液比的增大，有兩種影響結(jié)果，①使籽粕中的油脂提取率增大；②因油脂在提取劑中的溶質(zhì)濃度影響效應(yīng)，溶劑的沸點(diǎn)會(huì)下降，致使索氏提取器中單位時(shí)間的虹吸次數(shù)會(huì)降低。本試驗(yàn)中，在料液比為1∶12～1∶16(m∶V)時(shí)，第一種影響結(jié)果起主要作用，當(dāng)料液比大于1∶16(m∶V)之后，第二種影響結(jié)果起主要作用；兩種影響結(jié)果共同作用的結(jié)果使料液比1∶16(m∶V)之后提取率會(huì)稍有下降。故選擇料液比1∶16(m∶V)為最佳提取料液比。

2.1.5 L9(33)正交試驗(yàn) 根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，取得油率較高時(shí)的單因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal teston extraction conditions of Canarium pimela seed oil

表2 L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析表Table2 Intuitive analysis resultof orthogonal testwith L9(33)

由表2可知，各因素對種仁油提取效果的影響程度順序是B＞C＞A，最佳組合為A3B3C3，即以石油醚為浸提溶劑，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間5 h，料液比1∶18(m∶V)。

由表3可知，提取時(shí)間、提取溫度以及料液比3個(gè)因素對烏欖種仁油提取效果的影響沒有差異性。

表3 方差分析表Table3 Variance analysis table

為了確定正交試驗(yàn)最佳組合的再現(xiàn)性，進(jìn)行了最佳組合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，即以石油醚為浸提溶劑，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間5 h，料液比1∶18(m∶V)為提取條件，測得的種仁油得率為71.4%，大于正交試驗(yàn)測得的最高籽油得率的組合70.6%，證明確定的最佳組合是正確的。

2.2 烏欖種仁油GC-MS定性和定量分析

烏欖種仁油脂肪酸甲酯的GC—MS總離子色譜圖見圖5。由圖5可知，色譜分離出4個(gè)峰，表明烏欖種仁油是由4種化合物組成，根據(jù)GC—MS聯(lián)用測定所得到的質(zhì)譜信息，應(yīng)用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并對檢索結(jié)果進(jìn)行人工核對，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照、分析，確定了烏欖種仁油組成成分的結(jié)構(gòu)[11,12]，并按照峰面積歸一法計(jì)算可算出各組成化合物的相對百分含量。烏欖種仁油脂肪酸組成分析鑒定結(jié)果見表4。烏欖種仁油中主要含有亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸，其中亞油酸、油酸和棕櫚酸是其主要成分，占烏欖種仁油組成的95.17%。烏欖種仁油中飽和脂肪酸僅占39.79%，而不飽和脂肪酸含量為60.21%。

圖5 烏欖種仁油脂肪酸甲酯的GC—MS總離子流色譜圖Figure 5 GC—MS total ion chromatogram of kernel oil from Canarium pimela

表4 烏欖種仁油脂肪酸甲酯衍生物的GC—MS分析結(jié)果Table4 Identification results of chemical constituents for the kernel oil of Canarium pimela

2.3 烏欖種仁油與棕櫚油脂肪酸組成比較

由表5可知，雖然烏欖種仁油的脂肪酸組成與普通的“油酸—亞油酸”類油脂差異較大，但是除了單不飽和脂肪酸(油酸)和多不飽和脂肪酸與棕櫚油差別較大外，其總飽和脂肪酸和總不飽和脂肪酸的百分含量與棕櫚油相近[13]，故可以將烏欖種仁油歸為“棕櫚酸類油脂”。烏欖種仁油的穩(wěn)定性僅次于棕櫚油，是一種穩(wěn)定性較高的油脂，可以長期儲(chǔ)存，可以做烹飪、煎炸用油，也可以作為代用可可脂的原料。多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸之比(PUFA/SFA)為0.90，營養(yǎng)價(jià)值高于棕櫚油 (PUFA/SFA 0.23)。

2.4 烏欖種仁油理化性質(zhì)分析

烏欖種仁油部分理化指標(biāo)見表6。

由表6可知，烏欖種仁油的比重為0.911 3 g/cm3，折光指數(shù)為1.469 1，與其它一般常見植物油基本一致；酸價(jià)0.989mg/g，表明其游離脂肪酸含量很低；碘價(jià)為84.6 g/100 g，低于多數(shù)植物油，顯示其不飽和脂肪酸含量偏低；皂化價(jià)為186.2mg/g，與其它常見的植物油相比較低，則說明烏欖種仁油中脂肪酸平均分子量較小。

表5 烏欖種仁油與棕櫚油脂肪酸含量比較Table5 Comparison on fatty acid constituent contentof kernel oil from Canarium pimela with palm oil /%

表6 烏欖種仁油部分理化指標(biāo)Table6 Partof physical and chemical indicators of kernel oil from Canarium pimela

3 結(jié)論

以石油醚為浸提溶劑，利用索氏提取法提取得到的烏欖種仁油樣為呈明亮淡黃色的透明液體，散發(fā)出一股淡淡的油香味，提取率71.4%。烏欖種仁油中不飽和脂肪酸含量較高(60.21%)，主要成分為油酸和亞油酸。亞油酸是人體內(nèi)制造磷質(zhì)、膽固醇、糖質(zhì)和前列腺素等的必須脂肪酸[4]。所以它是人體獲取多不飽和脂肪酸的良好食物來源。

潮汕地區(qū)烏欖資源豐富，如果在采摘后，先將果肉和果仁進(jìn)行分離，果肉用于腌制橄欖菜，果核去掉內(nèi)果皮后，對果仁壓榨制備烏欖種仁油。不僅可以減少果仁的浪費(fèi)，也可以大大提高烏欖的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。所以烏欖開發(fā)前景良好。

1 楊永利,郭守軍,馬瑞君,等.烏欖葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析[J].廣西植物,2007,27(4):662～664.

2 鐘桂紅,丁冬純,周燕芳.烏欖果及其種子營養(yǎng)成分分析[J].江西化工,2008(3):81～82.

3 吳修仁.潮汕生物資源志略[M].廣州:中山大學(xué)出版社,1997:297.

4 郭守軍,楊永利,黃佳紅,等.烏欖果實(shí)揮發(fā)性化學(xué)成分的GC—MS分析[J].食品科學(xué),2009,30(12):251～253.

5 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海科技出版社,1986:467～472.

6 董艷芬,梁燕玲,羅艷,等.烏欖果降壓作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2006,19(8):880～882.

7 丁冬純,鐘桂紅,周燕芳,等.烏欖中礦質(zhì)元素含量的測定[J].廣東微量元素科學(xué),2008,15(8):54～56.

8 楊永利,郭守軍,莊浩川,等.烏欖果皮色素的提取工藝及穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2007,28(5):109～114.

9 云淑娟,林榮鋒,李秉超,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選香菜籽揮發(fā)油提取工藝及抑菌作用研究[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(6):76～79.

10 孔維軍,趙艷玲,山麗梅,等.正交法優(yōu)選干姜揮發(fā)油提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué),2009(3):23～24.

11 張京芳，張存莉，歲立云，等.香椿籽油浸提、精煉及理化特性分析[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(3)：136～139.

12 賴錫湖,黃卓,李堅(jiān),等.超臨界CO2萃取茶葉籽油及其成分分析[J].食品與機(jī)械,2011,27(2):38～40.

13 公譜,鄧干然,曹建華,等.棕櫚油的螺旋壓榨制取及其脂肪酸組分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3 659～3 661