巫春寧 林向陽 王長春 鄭為東 葉南慧 吳 佳

WU Chun-ning LIN Xiang-yang WANG Chang-chun ZHENGWei-dong YE Nan-hui WU Jia

（福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108)

(College of Biology Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou,Fujian 350108,China)

原花青素（proanthocyanidins，PC）是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，屬于植物多酚類物質(zhì)[1]。原花青素水溶性好，極易被機體吸收，生物利用度高達90%以上，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑和自由基清除劑，其在體內(nèi)抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍[2,3]。

早期的原花青素原料主要來源于松樹皮，后來發(fā)現(xiàn)從葡萄籽中提取的原花青素純度更高、質(zhì)量更好、功效更強，因而成為國際市場上生產(chǎn)原花青素的最主要原料。在歐美發(fā)達國家，以葡萄籽提取物——原花青素為主要原料膳食補充劑已被廣泛利用多年，人們每天補充或者使用葡萄籽提取物（原花青素產(chǎn)品）已經(jīng)形成一種良好的生活習(xí)慣，就如同每天補充維生素一樣。

葡萄籽是葡萄酒廠的下腳料，經(jīng)曬干后分離葡萄皮、葡萄梗后所得產(chǎn)物。葡萄籽含有豐富的各種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等。據(jù)中商情報網(wǎng)[4]數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2011年1～12月，中國葡萄酒的產(chǎn)量達11.6億L，而葡萄籽作為葡萄酒行業(yè)的主要副產(chǎn)品，每年的產(chǎn)量都非?？捎^，而且最近幾年在逐步遞增，為此，可以充分利用這部分資源創(chuàng)造高附加產(chǎn)值。通過超聲波輔助提取葡萄籽中的原花青素，再將其濃縮，冷凍干燥成粉狀，作為片劑主成分，輔以甘露糖及羥丙甲纖維素（HPCM）等，經(jīng)混合、造粒、干燥、壓片等工序，制成了低熱量、具有保健功能的口含片。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：安徽毫州公司；

原花青素標準品：阿拉丁試劑有限公司；

阿斯巴甜：常茂生物化學(xué)工程股份有限公司；

羥丙甲纖維素（HPCM）：安徽山河藥用輔料有限公司；

藥用滑石粉：廣西桂林市海達滑石制品有限公司；

聚乙二醇：湖南華日制藥有限公司；

微晶纖維素：安徽山河藥用輔料有限公司；

β-環(huán)糊精：孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司；

香草醛、鹽酸、乙醇、甲醇等：均為分析純，市售。

1.2 儀器與設(shè)備

三頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超市儀器有限公司；

紫外分光光度計：UV-1100型，上海美譜達儀器有限公司；

單沖壓片機：TDP-1.5型，中南制藥機械廠；

冷凍干燥機：FD5-series型，西盟國際集團；

低速離心機：SC-3612型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：BL150型，德國賽多利斯集團；

低熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：N-1001型，上海愛明儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄籽中原花青素含量的測定 采用香草醛—鹽酸法[5]。

1.3.2 樣品中原花青素提取率的計算 取一定量葡萄籽粉，用乙醇進行超聲波浸提后，于離心機4 000 r/min離心20 min，取0.5 mL上清液，稀釋1倍，測定其吸光度。通過標準曲線計算提取液中原花青素的含量，并按式(1)計算其提取率。

式中：

R——原花青素提取率，%；

V——提取液體積，mL；

m——每毫升提取液（稀釋后）中原花青素的量，mg；

M——葡萄籽質(zhì)量，g。

1.4 原花青素提取工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲波頻率對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時間20min，超聲波功率240W，考察不同超聲波頻率（40，80，100 kHz）對葡萄籽提取率的影響。

1.4.2 物料目數(shù)對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g粉碎葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時間20 min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察過不同目數(shù)（20,30,40,50,60）的葡萄籽粉末對葡萄籽提取率的影響。

1.4.3 乙醇濃度對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定料液比1∶10(m∶m)，溫度40℃，提取時間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同乙醇濃度（35%，45%，55%，65%，75%，85%，95%）對葡萄籽提取率的影響。

1.4.4 超聲波功率對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，溫度40 ℃，提取時間 20min，超聲波頻率 80 kHz，考察不同超聲波功率（120，150，180，210，240，270，300W）對葡萄籽提取率的影響。

1.4.5 提取溫度對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取時間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同溫度（25，35，45，55，65，75 ℃）對葡萄籽提取率的影響。

1.4.6 提取時間對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，料液比1∶10(m∶m)，提取時間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同時間(10，20，30，40，50，60min)對葡萄籽提取率的影響。

1.4.7 液料比對原花青素提取率的影響 準確稱取2.00 g過30目篩的葡萄籽，固定乙醇濃度60%，溫度40℃，提取時間20min，超聲波功率240W，超聲波頻率80 kHz，考察不同料液比質(zhì)量比分別為(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)對考察葡萄籽提取率的影響。

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，分析超聲波頻率、物料目數(shù)、提取溶劑（乙醇濃度）、超聲波功率、提取溫度、時間、料液比等因素對指標（原花青素提取率）的影響，選出對其影響最顯著的因素，再采用中心組合設(shè)計（CCD）進行響應(yīng)面試驗分析。

1.5 提取液的處理及壓片

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對提取液進行濃縮后，再冷凍干燥，得粉末狀提取物，再將其運用到含片中。以感官評定標準（表1）為指標，探究輔料種類、配比對葡萄籽含片組織狀態(tài)、風(fēng)味、口感、硬度、色澤的影響。

表1 口含片感官質(zhì)量評分標準Table1 Marking standards about sensory evaluation of tablet

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.1.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析 在單因素及綜合分析基礎(chǔ)上，擇優(yōu)選取乙醇濃度、溫度、時間進行RSM三因素三水平試驗，因素水平表見表2，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面因素與水平表Table2 Factors and levels of RSM

2.1.2 模型的建立及方差分析 由表4可知，試驗數(shù)據(jù)所得模型的F值為22.90，模型P<0.000 1，表示該模型極其顯著。失擬項的F值為0.78，P值為0.602 0不顯著，表明該方程擬合性好，可用回歸方程來預(yù)測實際的試驗結(jié)果。

由表5可知，該模型對超聲波提取葡萄籽中原花青素進行分析和預(yù)測對實踐具有指導(dǎo)意義。由模型擬合得到的編碼響應(yīng)面二次回歸模型R=+2.49-0.17A+0.019B+0.081C-0.019AB+0.057AC-0.027BC-0.21A2-0.088B2-0.10C2，其方程R2為0.953 7。通過求方程極值得到的最優(yōu)提取工藝：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時間42.74 min，最大預(yù)測值為2.534%。

2.1.3 試驗因素及交互作用對原花青素提取率的影響

(1)乙醇濃度、溫度及其交互作用對原花青素提取率的影響：由圖1可知，在提取時間40min條件下，當提取溫度為35℃時，原花青素提取率隨著乙醇濃度的上升而增大，當達到一定值后，又下降，這主要是因為原花青素易溶于極性溶劑，但達到一定限度時，反而會隨著溶劑極性的增強而降低。而當乙醇濃度為65%時，溫度對原花青素提取率的影響呈較為平緩的趨勢。

表3 響應(yīng)面中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Response surface central composite design arrangementand experimental results

表4 試驗結(jié)果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

表4 試驗結(jié)果方差分析表Table4 Analysis of variance for the experimental results

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

變異來源模型A-乙醇濃度B-溫度C-時間AB AC BC A2 B2 C2殘差失擬項純誤差總值SS 1.29 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 0.063 0.028 0.035 1.36 df 91 1 11 1 1 1 1 1 1 0 5 5 1 9 MS 0.14 0.39 4.971E-003 0.090 3.04E-003 0.026 5.724E-003 0.62 0.11 0.16 6.279E-003 5.519E-003 7.038E-003 F 22.90 62.39 0.79 14.38 0.48 4.10 0.91 98.65 17.70 24.70 0.78 P<0.000 1<0.000 1 0.394 5 0.003 5 0.502 2 0.070 3 0.362 2<0.000 1 0.001 8 0.000 6 0.602 0顯著度********不顯著

表5 模型可信度分析Table5 Analysis ofmodel reliability

(2)乙醇濃度、時間及交互作用對原花青素提取率的影響：由圖2可知，在溫度45℃條件下，當提取時間為20min時，原花青素提取率隨著乙醇濃度的上升而增大，當達到一定值后，又下降。當乙醇濃度為65%時，原花青素提取率會隨著提取時間的延長而提高，而后呈現(xiàn)略微下降趨勢，當超聲波時間較短時，原花青素不易溶出，原花青素提取率隨提取時間的延長而增大，但超聲時間過長一方面，耗時，另一方面提取液經(jīng)長時間超聲空化效應(yīng)，增加了超聲波作用強度，破壞了原花青素母核的結(jié)構(gòu)，且導(dǎo)致溫度升高，不利于原花青素的提取[6,7]。

(3)溫度、時間及交互作用對原花青素提取率的影響：由圖3可知，在乙醇濃度為75%條件下，當提取時間為20min時，原花青素提取率隨著溫度的上升而增大，當達到一定值后，又下降。當溫度為35℃時，原花青素提取率會隨著提取時間的延長而提高，而后呈平緩，略微下降趨勢。

圖1 乙醇濃度，溫度及其交互作用對原花青素提取率的影響Figure 1 Effectof Concentration of ethanol,tempertature and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

圖2 乙醇濃度，時間及其交互作用對原花青素提取率的影響Figure 2 Effectof Concentration of ethanol,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

圖3 溫度，時間及其交互作用對原花青素提取率的影響Figure 3 Effectof temperature,time and their interaction on the influence of yield of proanthocyanidins

2.1.4 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取條件：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時間42.74 min，在此條件下，進行驗證實驗。原花青素提取率為2.521%，相對于預(yù)測值2.534%，其相對誤差為0.51%，充分驗證了所建模型的正確性。

2.2 壓片工藝

2.2.1 填充劑、黏合劑對含片質(zhì)量的影響 由表6可知，甘露醇和乳糖的填充效果最佳，3%的HPCM的黏合效果最好。由于水易被物料迅速吸收，難以分散均勻，造成結(jié)塊等現(xiàn)象，所制成的顆粒也松緊不勻而影響片劑的質(zhì)量[8]；而用80%乙醇和8%淀粉漿，雖然效果會好些，但制成的顆粒粉末較多，顆粒大小分布不均勻,且操作過程中要迅速，以免醇揮發(fā)后，軟材變硬或結(jié)塊，影響制粒[9]。故綜合考慮選用3%HPCM乙醇溶液作為黏合劑，進行壓片。甘露醇在口腔含化過程中，有負熱效應(yīng)，故在口腔中溶解有清涼感，適用于口含片，但若選用單一的甜味劑，甜味較為單調(diào)，不夠醇厚，再者甘露醇流動性較差而且價格較貴，故將甘露醇配合乳糖（4∶1）、矯味劑（阿斯巴甜）進行壓片使用。

表6 填充劑、粘合劑對含片感官質(zhì)量的影響Table6 Effectof filler and adhesive on aesthetic quality of tablet

2.2.2 潤滑劑對含片質(zhì)量的影響 休止角越小，說明顆粒具有更好的流動性，據(jù)表7可知硬脂酸鎂的潤滑效果最好，可以使含片的片重均勻，而且能減少粘沖現(xiàn)象，使含片表面光滑。從感官評定得分，知硬脂酸鎂的添加較不會對含片口感產(chǎn)生影響，而加滑石粉制得的口含片口感較差，有苦味，而加聚乙二醇制成的片子脫膜效果好，但其本身有苦澀味，口感不佳[10-13]。

表7 潤滑劑對含片感官質(zhì)量的影響Table7 Effectof lubricanton aesthetic quality of tablet

2.2.3 干燥溫度及時間對含片質(zhì)量的影響 軟材造粒后，要迅速干燥，否則易結(jié)塊，影響后續(xù)的壓片效果。因含片中葡萄籽提取物（主要成分原花青素），在高溫下易氧化，而失去功效，且會造成軟材中的糖分熔化，使顆粒容易結(jié)塊、堅硬；而干燥溫度過低，又將延長干燥時間，降低生產(chǎn)效率。由表8可知，造粒后置于烘箱中50℃干燥90min制得的含片顆粒緊湊，硬度合適，無裂片，碎片。

2.2.4 葡萄籽提取物的包合及配方研究 因葡萄籽提取物，有苦澀味，穩(wěn)定性不好，故選用β-環(huán)糊精對葡萄籽提取物進行包埋，以此來掩蓋其苦澀味。經(jīng)前期試驗，得出將0.45 g葡萄籽提取物置于45℃、50 g的β-環(huán)糊精飽和溶液中包埋42min，得到的包埋物口感效果好。而后考察包合物與填充劑的配比（總用量92%）情況，檸檬酸與阿斯巴甜配比(總用量2%)對含片配方的影響。

由表9可知，當包合物與填充劑配比為1∶3，檸檬酸與阿斯巴甜配比為1∶1時，得出的葡萄籽含片外形圓整(直徑0.8 cm)，含片表面光滑，色澤均勻，入口順滑，清涼爽口，酸甜適宜，每片重（0.27±0.03）g。

表8 干燥溫度及時間對含片感官質(zhì)量的影響Table8 Effect of drying temperature and time on aesthetic quality of tablet

表9 主輔配料對含片質(zhì)量的影響Table9 Effectof ingredients on aesthetic quality of tablet

3 結(jié)論

(1)采用超聲波輔助提取葡萄籽中的功能性成分——原花青素，通過單因素和響應(yīng)面分析得出提取最佳工藝條件：乙醇濃度71.25%，溫度46.08℃，時間42.74 min,在此條件下，原花青素提取率為2.521%，相對于預(yù)測值2.534%，其相對誤差為0.51%，充分驗證了所建模型的正確性。

(2)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液進行濃縮后，于冷凍干燥機中干燥制成粉末，將其用于含片的制作，得出當包合物與填充劑配比1∶3（92%），檸檬酸與阿斯巴甜配比為1∶1（2%），3%HPCM的乙醇溶液（4.5%），硬脂酸鎂為1%時，得出的葡萄籽含片（0.27±0.03）g/片表面光滑，色澤均勻，入口順滑，清涼爽口，酸甜適宜，適合廣大消費群體的功能性保健含片。

(3)葡萄籽提取物，輔以不同的配料，經(jīng)混合、造粒、干燥、壓片等工序，雖制成了低熱量口含片，但還缺少含片的滅菌及包裝，具體的保健效果及功效還有待考究，后期將對含片功能性成分的釋放及對人體的保健效果進行深入探究。

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