卓文利 蔡錦全 付云烽 朱榕城 徐廷昭 吳衛(wèi)真 楊順良 譚建明

超順磁性氧化鐵標(biāo)記對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化能力的影響

卓文利 蔡錦全 付云烽 朱榕城 徐廷昭 吳衛(wèi)真 楊順良 譚建明

目的 利用超順磁性氧化鐵（SPIO）標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSC），探討其對BMSC增殖和分化能力的影響。方法分離、純化及培養(yǎng)大鼠BMSC。取第3代BMSC，用終濃度為25.0 μg/ml的SPIO-多聚賴氨酸（PLL）復(fù)合物進行標(biāo)記。未標(biāo)記的BMSC作為對照組。標(biāo)記后動態(tài)觀察MSC的形態(tài)改變，用臺盼藍染色檢測細胞的活力，采用細胞計數(shù)（CCK-8）試劑盒檢測BMSC增殖能力，普魯士藍鐵染色證實細胞內(nèi)鐵，臺盼藍染測細胞活力，成脂和成骨誘導(dǎo)檢測細胞的分化能力，評價SPIO標(biāo)記對BMSC增殖和分化能力的影響。SPIO對細胞活力和細胞增殖能力影響的組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。結(jié)果BMSC的SPIO標(biāo)記陽性率達（97.8 ± 2.1）﹪，標(biāo)記組和未標(biāo)記組細胞的活細胞率分別為（94.15 ± 1.56）﹪和（95.63 ± 0.87）﹪，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.283，P = 0.205)。SPIO標(biāo)記細胞的形態(tài)、生長增殖能力與未標(biāo)記細胞相比，1 ～ 7 d標(biāo)記組細胞增殖率為（96 ～ 98）﹪，未標(biāo)記組為（92 ～ 96）﹪，兩組差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.172 ～ 0.199，P = 0.679 ～ 0.710）。結(jié)論PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記BMSC方法簡便、效率高，對BMSC的增殖和分化能力無明顯影響，可用于BMSC的活體示蹤。

骨髓間充質(zhì)干細胞； 細胞增殖； 細胞分化； 大鼠； 超順磁性氧化鐵

近年來，磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等分子影像學(xué)技術(shù)越來越多地應(yīng)用于細胞標(biāo)記后的活體示蹤。MRI空間分辨率高，以超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）標(biāo)記干細胞，是干細胞移植后MRI活體示蹤的常用手段。移植前對干細胞進行安全、有效的磁標(biāo)記，是成功施行干細胞移植和MRI評價的必要前提。本實驗旨在探討轉(zhuǎn)染劑多聚賴氨酸（poly-L-1ysine，PLL）介導(dǎo)SPIO標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）的方法和效果，并于體外初步觀察其對BMSC的增殖能力、活力以及分化潛能等生物學(xué)特性的影響，為干細胞移植的示蹤提供實驗依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：Percol1分離液（瑞典Amershan-Pharmacia公司），α-DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），PBS平衡鹽溶液、胰蛋白酶-EDTA（美國Sigma公司），胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司），SPIO（Resovist，德國Schering公司）,PLL（美國Sigma公司）等。

2.主要儀器：超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），BECKMAN COULTER高速冷凍離心機（美國Beckman公司），CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本Nikon公司）等。

3.實驗動物：4 ～ 6周齡SD大鼠2只，體質(zhì)量60 ～ 80 g，雌雄不限，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

二、方法

試驗分為SPIO標(biāo)記BMSC組和非SPIO標(biāo)記BMSC組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1. SD大鼠BMSC分離、培養(yǎng)、純化及形態(tài)學(xué)觀察：參照文獻[1]對大鼠BMSC進行分離、培養(yǎng)、純化。活細胞倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長情況，適時拍照，并進行HE染色。

2. SPIO標(biāo)記BMSC：將第3代含間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的DMEM懸液移入放置有蓋玻片的六孔板中，置37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱中孵育3 ～ 4 h待細胞貼壁。將菲立磁與PLL混合，振蕩30 min后形成菲立磁復(fù)合物。將菲立磁復(fù)合物加入到含有MSC的DMEM低糖培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)0.2的胎牛血清+慶大霉素40 U/ml +青霉素40 U/ml）中，培養(yǎng)液中菲立磁-PLL的終濃度25.0 μg/ml。在37℃、5﹪CO2培養(yǎng)箱孵育24 h。

3. SPIO標(biāo)記BMSC的標(biāo)記率（普魯士藍染色法）：MSC以4﹪多聚甲醛室溫固定30 min。取出蓋玻片，用2﹪亞鐵氰化鉀-6﹪鹽酸染色30 min，Hank液洗滌3次，鏡檢。加中性紅復(fù)染2 min，Hank液洗滌3次，再次鏡檢。標(biāo)記率計算：普魯士藍染色后，低倍鏡下，隨機觀察3個視野，計算藍染著色的細胞數(shù)與鏡下細胞總數(shù)的比值。標(biāo)記率=藍染細胞數(shù)/鏡下總細胞數(shù)×100﹪。

4.臺盼藍染法檢測細胞活力：BMSC經(jīng)0.25﹪胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液1×106個細胞/ml，取9滴細胞懸液和1滴0.4﹪臺盼藍混勻，在3 min內(nèi)用細胞計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞。死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染。活細胞率（﹪）=活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）。

5. CCK-8試劑盒測定細胞增殖能力：BMSC經(jīng)0.25﹪胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，按1×103個細胞/孔等量接種于96孔培養(yǎng)板，24 h后使用SPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記BMSC，以未標(biāo)記的BMSC作為對照組，不含細胞的DMEM培養(yǎng)基作為空白對照，1 d后換成普通低糖DMEM培養(yǎng)基，以后每3 d換液。分別于標(biāo)記后第1、3、5及7 d加入含有10 μl CCK-8液的DMEM培養(yǎng)基110 μl，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，檢測波長450 nm，記錄不同時間點的吸光度，計算雙標(biāo)記組與對照組的相對吸光度，以反映細胞增殖能力。

6. BMSC多向分化能力鑒定：BMSC以5×103個/cm2密度接種至0.01﹪Ⅰ型膠原包被的24孔板，培養(yǎng)24 h后，使用SPIO-PLL復(fù)合物標(biāo)記BMSC，細胞生長至100﹪時，換為成脂誘導(dǎo)液或成骨誘導(dǎo)液持續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液，并于誘導(dǎo)2周后進行油紅O染色觀察成脂誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3周后茜素紅染色觀察成骨誘導(dǎo)情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，活細胞率和細胞增殖能力的相對光密度值用±s表示，其標(biāo)記組與非標(biāo)記組的組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗。以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SD大鼠BMSC的分離、培養(yǎng)、純化及形態(tài)學(xué)觀察

用淋巴細胞分離液對大鼠骨髓作密度梯度離心，可以看到明顯的4層，取中間云霧狀的白膜層進行培養(yǎng)，主要含單個核細胞，24 h后可見部分細胞貼壁；48 ～ 72 h后貼壁細胞明顯增多，逐漸伸長成梭形、多角形，伸出長短不一、粗細不均的胞質(zhì)突起，核居中，核仁1 ～ 4個，核漿比例大，3 ～ 4 d可見小的集落形成，未貼壁的細胞明顯增多在換液中被除去。原代培養(yǎng)中，細胞貼壁生長是以分散的、克隆集落方式增殖。8 ～ 14 d相鄰集落融合成片達80﹪以上，呈漩渦狀生長，克隆間出現(xiàn)重疊，無接觸抑制現(xiàn)象發(fā)生，克隆中除了含有小的梭形和大的扁平BMSC外，還有一種有更強折光性的小圓形細胞。傳代培養(yǎng)的細胞于2 ～ 4 h開始貼壁，24 h內(nèi)完全貼壁并伸展生長，形態(tài)與原代細胞相似，但增殖速度明顯增快，生長5 ～ 7 d細胞達90﹪融合，傳代后BMSC呈均勻分布的平均生長，小而圓的細胞隨著傳代而逐漸減少，第3代以后，細胞形態(tài)呈比較均一的成纖維狀，大部分呈長梭狀，排列規(guī)則（圖1）。

二、SPIO標(biāo)記對BMSC生物學(xué)特性的影響

1. SPIO標(biāo)記BMSC的標(biāo)記率：標(biāo)記細胞行普魯士藍染色觀察到MSC細胞質(zhì)內(nèi)可見陽性藍色致密顆粒分布。25.0 μg/ml BMSC的磁化標(biāo)記有效率為（97.8 ± 2.1）﹪（圖2），而未標(biāo)記的MSC普魯士監(jiān)染色未觀察到藍染顆粒，呈陰性。

圖1 SD大鼠BMSC細胞形態(tài)學(xué)觀察（×100）

圖2 SD大鼠經(jīng)SPIO標(biāo)記BMSC細胞質(zhì)致密顆粒改變

2. SPIO標(biāo)記后BMSC的細胞活力檢測：臺盼藍染法發(fā)現(xiàn)標(biāo)記組和未標(biāo)記組細胞的活細胞率分別為（94.15 ± 1.56）﹪和（95.63 ± 0.87）﹪，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.283，P = 0.205）。

3. BMSC的細胞增殖能力：SPIO標(biāo)記后第1、3、5、7天結(jié)果見表1，標(biāo)記與未標(biāo)記組的時間點細胞的相對吸光度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.172，P = 0.710,表1）。

表1 各標(biāo)記時間點SPIO標(biāo)記BMSC與未標(biāo)記BMSC的細胞相對吸光度（A，±s）

表1 各標(biāo)記時間點SPIO標(biāo)記BMSC與未標(biāo)記BMSC的細胞相對吸光度（A，±s）

注：SPIO為超順磁性氧化鐵；BMSC為骨髓間充質(zhì)干細胞

組 別 測孔數(shù) 不同標(biāo)記時間（d）1 3 5 7標(biāo)記組 3 98 ± 13 97 ± 14 96 ± 11 98 ± 10未標(biāo)記組 3 92 ± 15 93 ± 7 96 ± 13 95 ± 6 t 值 0.172 0.196 0.000 0.199 P 值 0.710 0.681 1.000 0.679

4. BMSC的細胞多向分化能力：SPIO標(biāo)記后BMSC誘導(dǎo)14 d，細胞內(nèi)可見大量透明脂滴形成，油紅O染色呈大小不等紅色小滴，與未標(biāo)記的BMSC無明顯差別。證實SPIO標(biāo)記不影響B(tài)MSC的向脂肪細胞分化潛能（圖3）。SPIO標(biāo)記后BMSC誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色可見細胞大量橘紅色鈣鹽沉積，部分呈“結(jié)節(jié)狀”，與未標(biāo)記的BMSC無明顯差別。

討 論

BMSC含量很低，大約每1 ～ 10萬個單核細胞中含有1個[2]。因此建立成熟的BMSC體外分離、培養(yǎng)、純化和擴增的方法，是利用BMSC進行廣泛深入的研究和臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。本實驗聯(lián)合運用密度梯度離心和貼壁篩選法，用1.073 g/ml的Percol1分離液分離大鼠BMSC，采用α-DMEM培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)，換液時去除不貼壁細胞，有利于獲得大量、高純度的MSC，并最大限度地保持細胞的活性。采用本方法獲得的第3代細胞純度達到97﹪以上，體外仍有很強的增殖能力，為體外大量擴增和臨床應(yīng)用BMSC奠定了基礎(chǔ)。

圖3 SD大鼠經(jīng)SPIO標(biāo)記BMSC油紅O染色后細胞內(nèi)脂滴形成

MRI是利用原子核在磁場內(nèi)共振產(chǎn)生的信號經(jīng)重建成像的一種成像技術(shù)，具有任意方向直接切層，不受組織深度限制，成像參數(shù)多，包含信息量大，而且無創(chuàng)、無射線和空間分辨率高等優(yōu)點。高分辨率的MRI可以無創(chuàng)性提供精確的解剖信息及生理參數(shù)。但是其敏感度還不足以從動物組織中區(qū)分出MSC，為了直接可視性觀察MSC，采用陽性或陰性造影劑是必須的。目前SPIO標(biāo)記細胞MRI掃描已經(jīng)成為一種活體研究細胞遷移軌跡的有用工具[3-6]。

SPIO可以有效地進行BMSC標(biāo)記，而這種標(biāo)記方法不會影響細胞的活力、生長、分裂、遷移和分化等生物學(xué)功能，對細胞沒有毒性，具有良好的安全性[7]。磁性標(biāo)記干細胞具有無創(chuàng)、可連續(xù)進行等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于干細胞移植治療腦、心肌、肝臟和腎臟損傷的體內(nèi)示蹤研究[8]。SPIO是目前最常用的干細胞標(biāo)記物，具有以下優(yōu)勢：（1）明顯增加MRI檢測的敏感性；（2）有多種商用的SPIO試劑如Endorem和Resovist等可供選擇[9]。SPIO作為標(biāo)記物自出現(xiàn)即受到廣大研究者的關(guān)注，大量有關(guān)干細胞的研究均采用了這種標(biāo)記物。如Hauger等[10]將SPIO標(biāo)記的MSC靜脈輸入腎小球損傷的動物體內(nèi)，取損傷腎組織進行檢測，通過普魯士蘭染色、免疫熒光和MRI等方法進行檢查都提示陽性。

SPIO轉(zhuǎn)染細胞的方法有直接轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法等。由于正常細胞和SPIO表面均帶負(fù)電荷，兩者親和力差，細胞難以攝取SPIO，故直接轉(zhuǎn)染法效率極低。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法雖然能提高轉(zhuǎn)染的效率，但其操作較繁雜，且對細胞損傷大，故亦較少使用。將SPIO與帶正電荷的轉(zhuǎn)染劑結(jié)合后能改變細胞表面電荷狀況，促進細胞對SPIO的胞吞和胞飲作用可大大地提高細胞的標(biāo)記效率，因其操作簡便而有效，是目前主流的細胞磁標(biāo)記方法[11]。常用的帶正電荷的轉(zhuǎn)染劑中以PLL的使用最為廣泛，一般認(rèn)為20 μg/ml左右的濃度是較適合的轉(zhuǎn)染濃度[12]。本實驗將SPIO（終濃度為20 μg/ml）與轉(zhuǎn)染劑PLL（終濃度為0.75 g/ml）混合振搖60 min后再與MSC孵育24 h，即可完成標(biāo)記工作，轉(zhuǎn)染后普魯氏藍染色證實MSC的陽性標(biāo)記率達（97.8 ± 2.1）﹪，說明該濃度的SPIO和PLL標(biāo)記MSC具有足夠的效率。

本實驗發(fā)現(xiàn)SPIO在終濃度為25 μg/ml時即可以對BMSC高效進行標(biāo)記，這一數(shù)據(jù)也是目前SPIO標(biāo)記干細胞的常用濃度，在這一濃度下細胞內(nèi)的SPIO粒子未對BMSC產(chǎn)生明顯毒性作用，而且對BMSC的活力、增殖和成脂、成骨分化潛能等一系列生物學(xué)特性無明顯的負(fù)面影響，說明干細胞的SPIO標(biāo)記是安全而有效的，SPIO終濃度25 μg/ml是安全、合適的標(biāo)記濃度，可用于干細胞的標(biāo)記示蹤。

綜上所述，SPIO對BMSC標(biāo)記效率高，無明顯細胞毒性，對BMSC的增殖和分化能力無明顯影響，有望為MRI活體成像示蹤移植后BMSC提供技術(shù)基礎(chǔ)，其活體應(yīng)用將是本實驗進一步研究的方向。

1 卓文利,付云烽,徐廷昭等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)純化及生物學(xué)特性的鑒定[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2009, 26(3):386-389.

2 Delorme B, Chateauvieux S, Charbord P. The concept of mesenchymal stem cells[J]. Regen Med, 2006, 1(4):497-509.

3 Moore A, Josephson L, Bhorade RM, et al. Human transferrin receptor gene as a marker gene for MR imaging[J]. Radiology, 2001, 221(1):244-250.

4 Moore A, Sun PZ, Cory D, et al. MRI of insulitis in autoimmune diabetes [J]. Magn Reson Med, 2002, 47(4):751-758.

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6 Lewin M, Carlesso N, Tung CH, et al. Tat peptidederivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells[J]. Nat Biotechnol, 2000, 18(4):410-414.

7 何庚戌,要彤,幺雯,等.超順磁性氧化鐵作為細胞標(biāo)記試劑的可行性研究[J]. 華北國防醫(yī)藥, 2009, 21(2):9-11.

8 劉宇,鄧宇斌,張德勝,等.蛛網(wǎng)膜下腔移植SPIO標(biāo)記的MSCs在大鼠脊髓損傷模型的MR活體示蹤研究[J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2009, 25(11):1933-1936.

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10 Hauger O, Frost EE, van Heeswijk R, et al. MR Evaluation of the glomerular homing of magnetically labeled mesenchymal stem cells in a rat model of nephropathy [J]. Radiology, 2006, 238(1):200-210.

11 陳國東,李丹,許杰華,等.超順磁性氧化鐵標(biāo)記對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 25(21):3566-3568.

12 Schafer R, Kehlbach R, Muller M, et a1. Labeling of human mesenchymal stromal cells with superparamagnetic iron oxide leads to a decrease in migration capacity and colony formation ability[J]. Cytotherapy, 2009, 11(1):68-78.

(本文編輯：李少婷)

卓文利，蔡錦全，付云烽，等. 超順磁性氧化鐵標(biāo)記對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化能力影響的實驗研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志：電子版, 2013, 3(1):2-6.

Proliferation and differentiation potential of rat bone marrow mesenchymal stem cells labeled with superparmagnetic iron oxide

ZHUO Wen-li, CAI Jin-quan, FU Yun-feng, ZHU Rong-cheng, XU Ting-zhao, WU Wei-zheng, YANG Shun-liang, TAN Jian-ming. Urology Department, Organ Transplant Institute, Fuzhou General Hospital, Fuzhou 350025, China

TAN Jian-ming, Email:doctortjm@yahoo.com

ObjectiveTo explore the methods of labeling bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) with superparamagnetic iron oxides (SPIO) and evaluate the influence of SPIO-PLL-labeling on the proliferation and differentiation potential of BMSC.MethodsRat BMSCs were isolated, and cultured-expanded. The third passage BMSCs were labelled with 25.0 μg/ml SPIO-PLL. Cell viability and proliferation were evaluated by the exclusion of CCK-8 and trypan blue dye respectively. The morphologic change of BMSC was observed by inverted phased microscope. Iron uptake via endocytosis was identified by prussian blue staining. The differentiation potential of BMSC toward adipocyte and osteoblast was assessed.ResultsThe percentage of iron-positive cells was (97.8 ± 2.1)﹪ after 24 h incubation with SPIO-PLL. The viability of SPIO-PLL-labelled BMSC and unlabelled BMSC was (94.15 ± 1.56)﹪and (95.63 ± 0.87)﹪ respectively (t = 2.283, P = 0.205). Cell shapes were similar. Cell proliferation rate was similar between the SPIO-PLL-labeled BMSCs and unlabelled MSCs

Bone marrow mesenchymal stem cell； Proliferation； Differentiation；Rats； Labeling superparmagnetic iron oxide

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.01.002

福建省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)計劃資助項目（2008J1006）；福建省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)項目（2010Y2006）：福建省青年人才基金（2008F3090）；中國博士后科學(xué)基金項目（20080441333）

350025 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院泌尿外科 全軍器官移植研究所

譚建明，Email：doctortjm@yahoo.comduring the first week (96 ～ 98)﹪ vs（92 ～ 96） ﹪ ,(t = 0.172 ～ 0.199，P = 0.679 ～ 0.710). Meanwhile, the differentiation capacity was preserved in labeled BMSC. Conclusions Labeling of BMSC with SPIO-PLL is convenient and effective, without any detrimental effects on the proliferation and differentiation of BMSC.

2012-05-12)