梁志鵬 楊波 楊英

骨髓增殖性腫瘤伴骨纖巨核細(xì)胞形態(tài)及BCR-ABL、JAK2V617F基因的相關(guān)性研究

梁志鵬 楊波 楊英

目的 探討和了解骨髓巨核細(xì)胞異形性改變在CML、ET、PV伴骨髓纖維組織增生中的診斷意義，分析BCR-ABL融合基因和JAK2V617突變對巨核細(xì)胞形態(tài)的影響及臨床意義。方法收集山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院2009年1月至2012年8月診治的CML、ET、PV患者的外周血常規(guī)檢查和骨髓活檢切片資料并進(jìn)行回顧性分析，將骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)分為七類，分別為Ⅰ型（單個核型）、Ⅱ型（多個核型）、Ⅲ型（多分葉型）、Ⅳ型（分葉不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核細(xì)胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。觀察骨髓切片中巨核細(xì)胞，通過卡方檢驗方法分析CML融合基因B3a2、B2a2，ET、PV JAK2V617F突變對巨核細(xì)胞形態(tài)影響的差異。結(jié)果各組巨核細(xì)胞均伴異形性改變，CML B3a2-1與B3a2-0、ET JAK2V617F(-)-1與JAK2V617F(-)-0、PV組巨核細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。骨小梁旁巨核細(xì)胞在ET JAK2V617F（+）-1與JAK2V617F（+）-0組有統(tǒng)計學(xué)差異（P = 0.000）、巨核細(xì)胞簇分別在CML B2a2-1與B2a2-0組、ET JAK2V617F（+）-1與JAK2V617F（+）-0組有統(tǒng)計學(xué)差異（P = 0.024,0.030）。結(jié)論CML-B2a2型、ET、PV中JAK2V617F突變伴骨髓纖維組織率高。巨核細(xì)胞簇和骨小梁旁巨核細(xì)胞、巨核細(xì)胞簇分別對B2a2、JAK2V617F突變伴骨纖程度輕微時有一定的早期診斷意義。

慢性粒細(xì)胞白血?。?血小板增多癥； 真性紅細(xì)胞增多癥； 骨髓纖維組織增生； 骨髓巨核細(xì)胞

骨髓增殖性腫瘤（chronicmyeloproliferative neoplasm，MPN）是一組以融合基因BCR-ABL和JAK2V617F突變?yōu)樘攸c(diǎn)的造血干細(xì)胞異常增殖性腫瘤，如慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）、真 性 紅 細(xì) 胞增多癥（polycythemia vera，PV）、骨髓纖維化（myelofi brosis，MF）、原發(fā)性血小板增多癥（essentia thrombocythemia，ET）。 在CML、ET、PV后期往往伴有骨髓纖維組織增生，在骨髓中以異形性巨核細(xì)胞的增多為特征［1-2］。相關(guān)研究表明骨髓纖維組織增生是預(yù)后不良的標(biāo)志且治療困難。本研究通過觀察骨髓巨核細(xì)胞異形性改變，分析BCR-ABL融合基因和JAK2V617F突變在CML、ET、PV伴骨髓纖維組織增生中的相關(guān)性，探索其在臨床早期診斷中的意義。

資料與方法

一、研究對象

收集2009年1月至2012年8月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院確診為MPN（CML、ET、PV）的門診和住院患者165例，男81例，女84例，中位年齡52歲。其中CML患者55例，男30例，女25例，中位年齡52歲，CML融合基因B3a2型20例，伴骨髓纖維組織增生13例，B2a2型30例，伴骨髓纖維組織增生24例；ET患者79例，男32例，女47例，中位年齡54歲，JAK2V617F突變者46例；PV患者31例，男19例，女12例，中位年齡57歲，JAK2V617F突變者23例。診斷參考2008年WHO造血與淋巴組織腫瘤分類方案［3］。

二、研究方法

1.巨核細(xì)胞分類：觀察骨髓病理活檢切片中巨核細(xì)胞形態(tài)并分類。參考文獻(xiàn)[4]提出的分型標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ型（單個核型）、Ⅱ型（多個核型）、Ⅲ型（多分葉型）、Ⅳ型（分葉不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核細(xì)胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。以上觀察和判斷均在2位經(jīng)驗豐富的形態(tài)學(xué)專業(yè)人員的輔助下完成。

2.網(wǎng)狀纖維的分布：觀察經(jīng)Gomori染色的骨髓切片，參考文獻(xiàn)[5]分級標(biāo)準(zhǔn)，骨纖程度分為-、+、++、+++、++++級。骨纖程度≥++為伴骨髓纖維組織增生。

3.分組：將CML患者分為B3a2-0、B3a2-1；B2a2-0、B2a2-1。其中B3a2、B2a2分別代表BCR-ABL融合基因的亞型（0代表不伴骨髓纖維組織增生，1代表伴骨髓纖維組織增生）。將ET和PV患者分為J AK2V617F（-）-0、JAK2V617F（-）-1；JAK2V617F（+）-0、JAK2V617F（+）-1。其中JAK2V617F（-）代表無突變，JAK2V617F（+）有突變，0代表不伴骨髓纖維組織增生，1代表骨髓纖維組織增生。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組異型巨核細(xì)胞分布、骨纖維組織等級指標(biāo)用相對數(shù)表示，組間差異采用秩和檢驗和精確概率法卡方檢驗；外周血細(xì)胞數(shù)采用±s表示，其不同類型組間差異采用獨(dú)立t檢驗，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、外周血常規(guī)結(jié)果

CML B3a2伴骨髓纖維組織增生患者血紅蛋白降低，有統(tǒng)計學(xué)差異（t = 2.920，P = 0.009），CML B2a2、ET和PV等組血紅蛋白、白細(xì)胞、血小板差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05，表1）。

二、骨髓纖維組織增生率

CML融 合 基 因B2a2、B3a2，ET和PV JAK2V617F陰性、陽性患者伴骨髓纖維組織增生率分別為80﹪、65﹪；21.9﹪、45.7﹪；0﹪、47.8﹪。骨纖程度以++ ～ +++為主（表2）。

三、骨髓巨核細(xì)胞異形性

觀察各組巨核細(xì)胞均伴有異形型改變，其中巨核細(xì)胞簇、骨小梁旁細(xì)胞和巨核細(xì)胞簇分別在CML B2a2組、ET伴JAK2V617F組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1，表3）。

表1 MPN各組外周血常規(guī)比較

圖1 在Olympus BX-51光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓切片中巨核細(xì)胞異形性改變

表2 不同類型MPN患者骨纖等級分布例數(shù)

討 論

CML、ET、PV發(fā)展過程中常伴有骨髓纖維組織增生，在疾病的晚期，骨髓巨核細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)也隨之發(fā)生改變。2008年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)將骨髓巨核細(xì)胞增殖和異形性改變伴網(wǎng)硬蛋白纖維化作為骨纖的首要診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，Thiele等[6]認(rèn)為異常形態(tài)的巨核細(xì)胞在伴骨髓纖維組織增生患者較多見，巨核細(xì)胞多形性改變的程度加重往往提示疾病預(yù)后不良。正確判斷骨髓纖維組織增生的程度對臨床治療方案的選擇與預(yù)后評估的相關(guān)研究日益受到重視[5]。

巨核細(xì)胞由骨髓造血干細(xì)胞分化而來，某些血液?。ㄈ鏜DS、CML、ET）伴有巨核細(xì)胞形態(tài)改變，出現(xiàn)病態(tài)巨核細(xì)胞[7]。在骨髓片中檢出病態(tài)巨核細(xì)胞，標(biāo)志著骨髓巨核細(xì)胞存在成熟障礙和病態(tài)造血，它的數(shù)量則反映了巨核細(xì)胞病態(tài)造血的嚴(yán)重程度[7]。異形性巨核細(xì)胞的數(shù)量增多亦是CML、ET、PV向骨髓纖維化發(fā)展的形態(tài)學(xué)特征[2]。正常巨核細(xì)胞分布在骨小梁間區(qū)的竇狀結(jié)構(gòu)旁，不發(fā)生成簇分布，巨核細(xì)胞成簇現(xiàn)象可以評估骨髓巨核細(xì)胞的顯著性增生或異常增殖。正常情況下，巨核細(xì)胞散在性定位于造血組織，當(dāng)骨髓增殖性腫瘤時，可移位于骨小梁旁區(qū)[2，4]。單個核、多個核常出現(xiàn)在CML加速期和急變期中。巨大多分葉巨核細(xì)胞也可在PV中觀察到，但并非ET所特有。大核小核型，是巨核細(xì)胞核分裂或分離形成。分葉不好型最不特異，可能是幾個核的重疊，良、惡性疾病中都可以出現(xiàn)[4]。以上巨核細(xì)胞異形性改變及分布與本研究結(jié)果相近。

表3 MPN各組異形性巨核細(xì)胞分布情況例數(shù)

JAK2V617F突變是診斷BCR-ABL陰性MPN新增加的一項指標(biāo)[3]。Kralovics定量分析JAK2V617F突變的純合子型骨髓增生性腫瘤患者具有較高的骨髓纖維化發(fā)生率[8-9]，其機(jī)制尚未明了。而本研究采用定性分析發(fā)現(xiàn)伴JAK2V617F突變的ET和PV患者也具有較高的骨纖發(fā)生率。此外，本研究中有12例ET、2例PV骨纖程度為+++ ～ ++++，而Swerdlow等[10]報道ET的網(wǎng)狀纖維正?；蜉p微增多（＜ ++），國際MPN研究和治療工作組（international working group for MPN research and treatment，IWG-MRT）將骨纖等級+++ ～ ++++作為診斷post-ET MF/ post-PV MF的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。post-ET MF/post-PV MF與MF臨床特點(diǎn)相似，都具有較高的轉(zhuǎn)白率[11]，可以為臨床分期提供有價值的實驗依據(jù)。文獻(xiàn)報道CML融合基因B2a2易發(fā)生急髓變，B3a2易發(fā)生急淋變[12]，且B2a2、B3a2與患者病程、生存期及骨纖發(fā)生率無關(guān)。而本研究還觀察發(fā)現(xiàn)到B2a2患者骨纖發(fā)生率高、異形性巨核細(xì)胞較多見，提示預(yù)后不良。本研究的結(jié)果顯示CML融合基因B2a2、ET伴JAK2V617F突變的伴骨髓纖維組織增生骨髓中巨核細(xì)胞成簇現(xiàn)象易出現(xiàn)。另外在伴JAK2V617F突變的伴骨髓纖維組織增生的ET骨髓中易見到巨核細(xì)胞移位于骨小梁旁，推測B3a2患者的預(yù)后可能優(yōu)于B2a2患者，JAK2V617F未突變的ET患者優(yōu)于突變者。文獻(xiàn)報道BCR-ABL是在P210蛋白水平影響CML的發(fā)生，未涉及到巨核系；野生型JAK2V617F通過激TPO的受體MPL使巨核細(xì)胞分化成熟[13]。Pich等[14]和Campbell等[15]研究認(rèn)為 JAK2V617F突變與骨纖程度、巨核細(xì)胞簇?zé)o相關(guān)聯(lián)系，而Ciurea等[16]和Kilpivaara等[17]在基因敲出的老鼠培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)JAK2V617F突變與巨核細(xì)胞成簇現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān)，與骨纖程度無明顯相關(guān)性。雖然本研究觀察的異形性巨核細(xì)胞在ET JAK2V617F陰性和PV伴骨髓纖維組織增生中均可見到，但受隨訪例數(shù)限制，應(yīng)還需增大樣本數(shù)量進(jìn)一步證實其與骨髓纖維組織增生的相關(guān)性。

本文研究的單個核、多個核、多分葉、分葉不好、大核小核型巨核細(xì)胞在伴骨髓纖維組織增生的骨髓組織切片中均可見到，結(jié)合相關(guān)基因的診斷，可以更好地為早期骨髓纖維化診斷提供線索。骨髓纖維化后期常表現(xiàn)為骨髓衰竭及較高的轉(zhuǎn)白率[11]，通過觀察異形性巨核細(xì)胞有助于早期追蹤骨髓纖維組織增生的發(fā)展，可為臨床治療方案的選擇提供診斷學(xué)基礎(chǔ)。

1 Michiels JJ, De Raeve H, Hebeda K, et al. WHO bone marrow features and European clinical, molecular, and pathological (ECMP) criteria for the diagnosis of myeloproliferative disorders[J]. Leuk Res, 2007, 31(8):1031-1038.

2 Balduini A, Badalucco S, Pugliano MT, et al. In vitro megakaryocyte differentiation and proplatelet formation in ph-negative classical myeloproliferative neoplasms: distinct patterns in the different clinical phenotypes[J]. PloS One, 2011, 6(6):e21015.

3 Vardiman JW. The world health organization (WHO) classifi cation of tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues:an overview with emphasis on the myeloid neoplasms[J]. ChemBiol Interact, 2010, 184(1-2):16-20.

4 盧興國.骨髓細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)診斷[M].北京：科學(xué)出版社, 2008:411-441.

5 陳輝樹.骨髓病理學(xué)[M]. 北京：人民軍醫(yī)出版社, 2010:8-11.

6 Passamonti F, Malabarba L, Orlandi E, et al. Polycythemiavera in young patients:a study on the longterm risk of thrombosis, myelofibrosis and leukemia[J]. Haematologica, 2003, 88(1):13-18.

7 Thiele J, Kvasnicka HM, Orazi A. Bone marrow histopathology in myeloproliferative disorders—current diagnostic approach[J]. Seminars in hematology, 2005, 42(4):184-195.

8 朱蕾,盧興國,趙小英,等.骨髓涂片和切片中的巨核細(xì)胞多形性改變在慢性骨髓增殖性疾病中的診斷意義[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 33(2):143-148.

9 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A gain-offunctionmutation of JAK2 in myeloproliferative disorders[J]. N Engl J Med, 2005, 352(17):1779-1790.

10 Passamonti F. Prognosticfactors and models in polycythemiavera, essential thrombocythemia, and primary myelofibrosis[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2011,Suppl 1:S25-727.

11 Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. World health organization classifi cation of tumours of the haematopietic and lymphoid tissues[M]. Lyon:Interationl Agency for Research on Cancer, 2008:31-64.

12 Tefferi A. Polycythemia vera and essential thrombocyt hemia:2012update on diagnosis, risk stratification, and management[J]. Am J Hematol, 2012, 87(3):285-293.

13 Polampalli S, Choughule A, Negi N, et al. Analysis and comparison of clinicohematological parameters and molecular and cytogenetic response of two Bcr/Abl fusion transcripts[J]. Genet Mol Res, 2008, 7(4):1138-1149.

14 Pich A, Riera L, Sismondi F, et al. JAK2V617F activating mutation is associated with the myeloproliferative type of chronic myelomonocytic leukaemia[J]. J ClinPathol, 2009, 62(9):798-801.

15 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2V617F mutation status: a prospective study[J]. Lancet, 2005, 366(9501):1945-1953.

16 Ciurea SO, Merchant D, Mahmud N, et al. Pivotal contributions of megakaryocytes to the biology of idiopathic myelofi brosis[J]. Blood, 2007, 110(3):986-993.

17 Kilpivaara O, Mukherjee S, Schram AM, et al. A germline JAK2 SNP is associated with predisposition to the development of JAK2(V617F)-positive myeloproliferative neoplasms[J]. Nat Genet, 2009, 41(4):455-459.

18 Li J, Spensberger D, Ahn JS, et al. JAK2 V617F impairs hematopoietic stem cell function in a conditional knockin mouse model of JAK2 V617F-positive essential thrombocythemia[J]. Blood, 2010, 116(9):1528-1538.

Correlation study of BCR-ABL, JAK-2 and the morphology of the bone marrow megakaryocytes in myeloproliferative neoplasms with myelofibrosis

LIANG Zhi-peng, YANG Bo，YANG Ying. Diagnostic Laboratory, the Second AffiliatedHospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

YANG Bo，Email：ty-yb@sohu.com

ObjectiveTo evaluate the morphologic features of CML, ET and PV with hyperplasia of fibrous tissue and their influence on bone marrow megakaryocytes in patients with BCR-ABL fusion gene and JAK2V617 mutation.MethodsWe retrospectively examined the diagnosis and treatment of CML, ET and PV with hyperplasia of fibrous tissue in our hospital from January 2009 to August 2012. Patients were divided into 7 groups according the types of morphologic features: typeⅠ( single karyotype ), typeⅡ( multiple karyotypes), typeⅢ(multiple split leaf type), typeⅣ (split leaves with poor prognosis),Ⅴ ( big nuclear small nuclear karyotype), typeⅥ(cluster),Ⅶ(trabecular side type). χ2test was used to evaluate the influence of fusion gene subtypes (B3a2, B2a2), ET, PV and JAK2V617 mutations on morphological differences of megakaryocytes.ResultsThe megakaryocytes were morphologically different among the groups. B3a2-1 group and B3a2-0 group were morphologically similar. JAK2V617F (-)-1, JAK2V617F (-)-0 of ET and PV groups were morphologically similar. For patients with cluster of megakaryocytes there was statistically difference between B2a2-1 and B2a2-0.For patients with trabecular side megakaryocyte there was statistically difference between JAK2V617F (+) -1, JAK2V617F (+) -0 of ET (P < 0.05) and JAK2V617F (+) -1 and JAK2V617F (+) -0 of ET (P = 0.024,0.030). Conclusions Incidence of myelofibrosis was higher in patients with fusion gene B2a2. Mgakaryocyte cell cluster is a good indicator of disease in patients with B2a2 and slight hyperplasia of fibrous tissue. In patients with JAK2V617 mutations of ET and PV, trabecular side type and cluster are helpful for early diagnosis.

Chronic myeloid leukemia； Thrombocytosis； Polycythemia vera； Bone marrow hyperplasia of fibrous tissue； Bone marrow megakaryocytes

2012-04-19)

(本文編輯：蔡曉珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.01.003

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)實驗室

楊波，Email：ty-yb@sohu.com

梁志鵬，楊波，楊英. 骨髓增殖性腫瘤伴骨纖巨核細(xì)胞形態(tài)及BCR-ABL、JAK2V617F基因的相關(guān)性研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版, 2013, 3(1):7-12.