UsuiJ 論著 黃梁滸 編譯

器官短缺已成為移植的主要瓶頸，而再生醫(yī)學(xué)為可移植器官提供了可能。器官發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞之間的相互作用十分復(fù)雜，無(wú)法在體外進(jìn)行重復(fù)。為了解決這個(gè)難題，Usui等曾在Pdx1-/-小鼠體內(nèi)利用囊胚互補(bǔ)作用，成功將外源多潛能干細(xì)胞（pluripotent stem cell，PSC）分化發(fā)育形成胰腺。在該新生胰腺中，整個(gè)胰腺幾乎是外源PSC發(fā)育而成。同時(shí)，該胰腺能產(chǎn)生包括胰島素在內(nèi)的多種激素，從該胰腺分離出來(lái)的胰島能明顯降低糖尿病小鼠的血糖。因此，該研究小組進(jìn)一步假設(shè)：通過(guò)基因操作技術(shù)，將小鼠囊胚制作成一個(gè)確定已無(wú)法發(fā)育成器官的突變小鼠囊胚，并將外源PSC導(dǎo)入其中，通過(guò)囊胚中殘留發(fā)育微環(huán)境（niche）的互補(bǔ)作用使得這些外源PSC得以分化發(fā)育，重新形成器官。

Sall1是spalt基因（果蠅屬）的同源基因，只在哺乳動(dòng)物中表達(dá)。Sall1基因平時(shí)處于關(guān)閉狀態(tài)，在胚胎發(fā)育時(shí)才會(huì)打開(kāi)，只在胚胎期和新生期的腎間質(zhì)中表達(dá)。該基因不僅是腎間質(zhì)與輸尿管芽之間相互吸引、相互作用時(shí)必需的，而且是上述兩者相互作用后腎間質(zhì)生長(zhǎng)、分化發(fā)育所必需的。如果Sall1基因缺陷，則會(huì)造成小鼠因腎臟發(fā)育不全而出生不久死亡。另一方面，不依賴Sall1基因的組織器官，如輸尿管、膀胱等都能正常發(fā)育。該研究小組利用該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察將外源胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）或誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）導(dǎo)入 Sall1-/-小鼠囊胚能否再生出新的腎臟。結(jié)果令人振奮，除了不受Sall1基因調(diào)控的集合管、微血管外，外源小鼠的PSC成功分化發(fā)育成新的腎臟，表明囊胚可被用來(lái)重新形成腎臟。

該小組首先將外源ESC導(dǎo)入受體小鼠囊胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Sall1+/+小鼠的新生子代腎臟均為紅色，表明其來(lái)源于DsRed標(biāo)記的外源ESC；Sall1+/EGFP小鼠的新生子代腎臟為黃色，表明其是由EGFP陽(yáng)性的受體鼠來(lái)源細(xì)胞（綠色）與導(dǎo)入的ESC來(lái)源細(xì)胞（紅色）整合而成；而未注入外源ESC的Sall1+/EGFP小鼠的新生小鼠腎臟只出現(xiàn)EGFP陽(yáng)性的細(xì)胞。同時(shí)，Sall1EGFP/EGFP小鼠的新生子代腎臟整體顯示紅色，且大小正常，提示這些細(xì)胞均是由DsRed標(biāo)記的ESC發(fā)育而來(lái)；但該小鼠的集合管呈綠色，提示由受體鼠囊胚細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，且其不表達(dá)Sall1基因。以上結(jié)果得到流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析和PCR基因鑒定的證實(shí)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，Sall1EGFP/EGFP和Sall1+/EGFP小鼠中注入外源ESC后，這些ESC不能發(fā)育成腎臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，只能發(fā)育為腎上腺、輸尿管、膀胱、脂肪等非腎臟組織，充分說(shuō)明Sall1EGFP/EGFP小鼠腎臟是通過(guò)外源ESC和受體鼠囊胚的互補(bǔ)共同發(fā)育而成。HE和PAM染色結(jié)果顯示，Sall1EGFP/EGFP小鼠的子代鼠腎組織（外源ESC分化而來(lái)）腎小球毛細(xì)血管袢和基底膜均發(fā)育正常，腎小球足細(xì)胞和鮑曼囊（Bowman’s capsule）內(nèi)皮細(xì)胞界限清晰。另外，外源ESC可以分化發(fā)育為多種不同的腎組織譜系細(xì)胞，表明利用囊胚互補(bǔ)技術(shù)是可以將外源性ESC分化發(fā)育成腎臟。

其次是用iPSC代替ESC，實(shí)驗(yàn)證實(shí)也可在受體小鼠囊胚中分化發(fā)育形成腎臟。利用Sall1基因敲除小鼠囊胚，將攜帶EGFP基因的iPSC注入其中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Sall1+/-或Sall1+/+新生嵌合小鼠腎臟部分顯示綠色熒光，提示這些細(xì)胞是由攜帶EGFP基因iPSC分化而來(lái)的細(xì)胞和受體鼠囊胚本身細(xì)胞共同組成；相反，Sall1-/-新生嵌合小鼠表達(dá)更多、更強(qiáng)綠色熒光，表明其腎臟完全由外源iPSC分化而來(lái)，同時(shí)其腎臟大小、外觀基本正常。另外，外源iPSC分化發(fā)育而來(lái)的膀胱充滿尿液，且其緊鄰腎臟，表明該腎臟能和膀胱正常相連，功能正常。在導(dǎo)入EGFP-iPSC的Sall1+/-和Sall1-/-嵌合小鼠中，發(fā)現(xiàn)這些iPSC還能分化發(fā)育成非腎臟組織，包括腎上腺、輸尿管、膀胱、肌肉和脂肪組織，外源性iPSC在小鼠胚胎中分化發(fā)育成何種組織細(xì)胞，依賴于小鼠和iPSC的嵌合程度。對(duì)外源性iPSC分化發(fā)育成的腎臟進(jìn)行組織學(xué)分析，iPSC + Sall1+/-和Sall1-/-嵌合新生小鼠腎組織中可見(jiàn)正常的腎皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)，熒光顯微鏡下基本呈綠色（EGFP）；腎小球毛細(xì)血管袢和基底膜形態(tài)正常；腎小球小體結(jié)構(gòu)明晰，開(kāi)口于球旁尿液連接結(jié)構(gòu)。超微結(jié)構(gòu)顯示，腎小球3層結(jié)構(gòu)完整，即有上皮細(xì)胞足突層、基底膜層、帶過(guò)濾孔的血管內(nèi)皮細(xì)胞層。以上結(jié)果提示這些小鼠腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)完整，功能正常，進(jìn)一步顯示了通過(guò)囊胚的互補(bǔ)作用可以讓外源性iPSC分化發(fā)育再生出新的腎臟。

為了證實(shí)上述結(jié)論，作者比較和分析了不同嵌合小鼠的免疫組織化學(xué)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入外源iPSC的Sall1+/+和Sall1+/-嵌合新生小鼠后腎間質(zhì)，包括每個(gè)腎單位的足細(xì)胞，均包含EGFP陽(yáng)性和陰性2種細(xì)胞；貫穿腎臟的整個(gè)發(fā)育過(guò)程，腎單位祖細(xì)胞、后腎間質(zhì)的上皮細(xì)胞（凝集間質(zhì)、前小管聚集體、逗狀小體、S形小體和成熟的腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管）均十分相似。此外，其他后腎間質(zhì)成份（鮑曼囊、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管的上皮細(xì)胞）也顯示出為EGFP陽(yáng)性和陰性2種足細(xì)胞的混合狀態(tài)。對(duì)導(dǎo)入外源iPSC的Sall1-/-嵌合小鼠腎組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析顯示，其后腎間質(zhì)（凝集間質(zhì)、前小管聚集體、逗狀小體、S形小體和發(fā)育成熟的腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管）均來(lái)源于iPSC）；大部分腎實(shí)質(zhì)（腎皮質(zhì)、髓質(zhì)、包膜）也來(lái)自iPSC集合管，輸尿管則由輸尿管芽發(fā)育而成，也就是說(shuō)，這些組織細(xì)胞的發(fā)育不受Sall1基因所調(diào)控。腎皮質(zhì)、髓質(zhì)和表達(dá)Liv2基因的腎包膜均被外源性iPSC分化發(fā)育的EGFP陽(yáng)性細(xì)胞所替代；泌尿脈管系統(tǒng)的所有血管內(nèi)皮細(xì)胞（包括動(dòng)脈、小動(dòng)脈、腎小球微動(dòng)脈、毛細(xì)胞血管、小靜脈）均顯示為嵌合結(jié)構(gòu)狀態(tài)，腎小球系膜（非血管壁平滑肌細(xì)胞）來(lái)源于iPSC，但所有血管周?chē)窠?jīng)均不是iPSC發(fā)育成的。這些結(jié)果表明：盡管外源iPSC可作為腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的種子細(xì)胞，但集合管上皮、腎間質(zhì)成份（包括血管、神經(jīng)）是由iPSC和受體小鼠囊胚共同發(fā)育而成。

以往該研究小組曾經(jīng)應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)，將大鼠iPSC導(dǎo)入Pdx1-/-小鼠胚胎后，成功培育出大鼠胰腺。同時(shí)作者曾將大鼠iPSC導(dǎo)入Sall1-/-小鼠囊胚，但未能成功發(fā)育為腎臟。如果參與小鼠后腎間質(zhì)和輸尿管芽之間作用的關(guān)鍵性分子，并不能在大鼠ESC或iPSC分化發(fā)育發(fā)揮類似作用，那么尋找一個(gè)真正缺失所有和腎臟分化發(fā)育相關(guān)細(xì)胞的小鼠囊胚（受體小鼠）已成為必要。盡管如此，該項(xiàng)研究成功應(yīng)用受體小鼠囊胚的互補(bǔ)作用，將導(dǎo)入的外源iPSC再生成具有完整功能的小鼠腎臟，該系統(tǒng)為腎臟發(fā)育提供了一種新思路，同時(shí)也為腎臟發(fā)育的細(xì)胞與分子機(jī)制展示了一個(gè)新的視野。

ESC或iPSC導(dǎo)入囊胚系統(tǒng)再生成腎臟示意圖