孫靈利 趙平 張建花 郭嬌 王甦民

結(jié)核病仍然是威脅人類健康的重要疾病，中國(guó)結(jié)核病患病率位居世界第二[1]，而耐藥肺結(jié)核位居世界第一[2]。結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)對(duì)結(jié)核病的控制至關(guān)重要，而細(xì)菌學(xué)診斷在結(jié)核病確診及傳染源的發(fā)現(xiàn)中起著決定性作用。細(xì)菌學(xué)診斷包括痰涂片找抗酸桿菌和培養(yǎng)。顯微鏡鏡檢是最普及和經(jīng)濟(jì)的方法，但敏感度低，并且不能區(qū)分死菌還是活菌。在我國(guó)培養(yǎng)法使用最多的是羅氏(L?wenstein-Jensen，L-J)固體培養(yǎng)法，但其培養(yǎng)周期長(zhǎng)，后來出現(xiàn)的快速培養(yǎng)系統(tǒng)如BacT/ALERT 3D系統(tǒng)和美國(guó)BD公司的自動(dòng)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(automated BACTEC MGIT 960 system, A-MGIT)在分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間和陽(yáng)性率方面均高于傳統(tǒng)的L-J固體培養(yǎng)方法，但這兩種培養(yǎng)系統(tǒng)儀器和試劑價(jià)格均較昂貴。最近出現(xiàn)的手工MGIT系統(tǒng)(manual mycobacteria growth indicator tube system，M-MGIT)價(jià)格低廉，設(shè)備小巧輕便，適合基層實(shí)驗(yàn)室使用。本研究主要對(duì)M-MGIT系統(tǒng)與L-J法和A-MGIT系統(tǒng)的培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其分離培養(yǎng)分枝桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、材料

1. 標(biāo)本來源：2012年1月至2013年2月，北京市朝陽(yáng)區(qū)疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病門診初診患者，按照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS 288-2008)》，根據(jù)患者臨床癥狀、體征及胸部影像學(xué)檢查確診或高度疑似為肺結(jié)核的患者納入本次研究。共有526例患者納入研究，其中男328例，女198例；平均年齡(35±14)歲，最小年齡15歲，最大年齡97歲。每例患者送檢3份痰標(biāo)本，分別為夜間痰、晨痰和即時(shí)痰，選取1份合格的、痰量在3～10 ml的痰標(biāo)本納入本研究，共有526份痰標(biāo)本納入本次研究。

2. 儀器和試劑：A-MGIT培養(yǎng)系統(tǒng)包括：BACTEC MGIT 960 自動(dòng)培養(yǎng)儀，7 ml液體培養(yǎng)管，MGIT營(yíng)養(yǎng)添加OADC(oleic acid-albumin-dextrose-catalase)，MGIT雜菌抑制劑PANTA(polymyxin B, amphotericin B, nalidixic acid, trimethoprim, and azlocillin)雜菌抑制劑，均為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。M-MGIT培養(yǎng)系統(tǒng)包括：熒光判讀儀，4 ml液體培養(yǎng)管，MGIT OADC營(yíng)養(yǎng)添加劑，MGIT PANTA雜菌抑制劑，均為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。L-J培養(yǎng)基和抗酸染色液均由珠海貝索生物有限公司生產(chǎn)。

二、方法

1. 涂片染色鏡檢及標(biāo)本的前處理：每份痰標(biāo)本先進(jìn)行涂片，涂片后剩余的標(biāo)本進(jìn)行處理后培養(yǎng)。涂片染色鏡檢及標(biāo)本前處理均按照文獻(xiàn)[3]規(guī)程操作，標(biāo)本處理采用N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)法。

2. L-J培養(yǎng)基分離培養(yǎng)：每份經(jīng)NALC-NaOH法處理的標(biāo)本接種2支改良L-J培養(yǎng)基，每支L-J培養(yǎng)基接種0.1 ml，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，接種后3、7 d分別觀察結(jié)果1次，然后每周觀察結(jié)果1次。發(fā)現(xiàn)菌落生長(zhǎng)，經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸分枝桿菌后報(bào)告陽(yáng)性，若為陰性報(bào)告污染。若觀察滿8周仍無菌落生長(zhǎng)，可報(bào)告陰性。

3. A-MGIT分離培養(yǎng)：將1瓶營(yíng)養(yǎng)添加劑MGIT OADC和1瓶雜菌抑制劑MGIT PANTA混合，取0.8 ml混合液加到7 ml液體培養(yǎng)管中。每支培養(yǎng)管中接種NALC-NaOH處理后的同份標(biāo)本(每份標(biāo)本處理完后分別接種L-J培養(yǎng)基2支，A-MGIT培養(yǎng)管1支，M-MGIT培養(yǎng)管1支)0.5 ml，接種后培養(yǎng)管經(jīng)掃描確認(rèn)，放入全自動(dòng)BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)儀中培養(yǎng)，由儀器自動(dòng)監(jiān)測(cè)。儀器提示陽(yáng)性后取出，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，經(jīng)抗酸染色鏡檢后證實(shí)為抗酸分枝桿菌后報(bào)告陽(yáng)性，若為陰性報(bào)告污染，陰性結(jié)果為培養(yǎng)42 d后儀器報(bào)告陰性后取出，對(duì)培養(yǎng)管底部沉淀物進(jìn)行抗酸染色鏡檢，判定是否假陰性。

4. M-MGIT分離培養(yǎng)：接種標(biāo)本前，在4 ml液體培養(yǎng)管中分別加入0.5 ml 營(yíng)養(yǎng)添加劑和0.1 ml 雜菌抑制劑，然后每管接種經(jīng)NALC-NaOH 法處理的同份標(biāo)本0.5 ml，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第2天開始，每天用熒光判讀儀對(duì)培養(yǎng)管進(jìn)行檢測(cè)。熒光判讀儀報(bào)告陽(yáng)性者，對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行涂片，抗酸染色鏡檢證實(shí)為抗酸分枝桿菌后報(bào)告陽(yáng)性，若為陰性報(bào)告，則報(bào)告污染。培養(yǎng)管連續(xù)培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)6周時(shí)，若熒光判讀儀報(bào)告陰性，則標(biāo)本報(bào)告為陰性，并對(duì)培養(yǎng)管底部沉淀物進(jìn)行涂片及抗酸染色鏡檢，判斷是否為假陰性。

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，3種方法率的比較采用χ2檢驗(yàn)，3種方法檢出分枝桿菌時(shí)間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同培養(yǎng)方法的檢出率比較

每份樣本同時(shí)進(jìn)行涂片鏡檢及3種方法分離培養(yǎng)，結(jié)果見表 l。3種不同培養(yǎng)方法共分離出261株分枝桿菌，檢出率為49.6%(261/526)；其中M-MGIT法分離培養(yǎng)出256株，檢出率為48.7%(256/526)；A-MGIT法分離培養(yǎng)出258株，檢出率為49.0%(258/526)；L-J法分離培養(yǎng)出217株，檢出率為41.3%(217/526)。M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法檢出率均高于L-J培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為5.84和6.45，P值分別為0.018和0.013)，但M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.02，P=0.951)。在146份涂片鏡檢抗酸桿菌陽(yáng)性(涂陽(yáng))標(biāo)本中，M-MGIT、A-MGIT和L-J 培養(yǎng)法陽(yáng)性檢出率分別為94.5%、93.8%和89.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.74，P=0.154)；在380份涂片鏡檢抗酸抗菌陰性(涂陰)標(biāo)本中，M-MGIT(31.1%)、A-MGIT(31.8%)培養(yǎng)法檢出率均高于L-J法(22.9%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為6.42和7.65，P值分別為0.014和0.007)；但M-MGIT與A-MGIT培養(yǎng)法的檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.05，P=0.876)。

表1 526份痰標(biāo)本的不同培養(yǎng)方法與痰涂片抗酸染色鏡檢檢出結(jié)果比較

注括號(hào)內(nèi)數(shù)值為構(gòu)成比(%)

二、不同培養(yǎng)方法的陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間比較

M-MGIT法平均陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間為13 d[(13±6)d]，A-MGIT法平均報(bào)告時(shí)間為12 d[(12±6)d]，L-J法平均報(bào)告時(shí)間為24 d[(24±9)d]。M-MGIT和A-MGIT法陽(yáng)性報(bào)告時(shí)間明顯短于L-J法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為15.84和18.32,P值均=0.000)，但M-MGIT和A-MGIT法之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.89，P=0.071)。M-MGIT法51.2%(131/256)的培養(yǎng)陽(yáng)性菌株和A-MGIT法52.7%(136/258)的培養(yǎng)陽(yáng)性菌株的報(bào)陽(yáng)時(shí)間在第2周內(nèi)，而L-J法37.8%(82/217)的菌株報(bào)陽(yáng)時(shí)間在第3周，35.5%(77/217)的菌株報(bào)陽(yáng)時(shí)間在第4周。

三、不同培養(yǎng)方法的污染率比較

M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法污染率分別為4.6%(24/526)和4.9%(26/526)，每份標(biāo)本接種L-J培養(yǎng)基2支，共1052支，污染43支，污染率為4.1%，三者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.64，P=0.726)。

討 論

BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)(A-MGIT)是一種全自動(dòng)的、高通量的、非放射性的液體培養(yǎng)方法，MGIT培養(yǎng)管底部包埋有熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)將隨著管內(nèi)氧含量的變化而發(fā)生反應(yīng)，若分枝桿菌在培養(yǎng)管中生長(zhǎng)消耗氧，管內(nèi)熒光物質(zhì)被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，系統(tǒng)每小時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)管內(nèi)的熒光強(qiáng)度一次，從而判斷管內(nèi)分枝桿菌生長(zhǎng)情況[4]。 A-MGIT系統(tǒng)已經(jīng)被證明是一種快速、簡(jiǎn)便，且敏感度較高的分枝桿菌培養(yǎng)系統(tǒng)[5-7]，但儀器價(jià)格昂貴，在基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室可能無法推廣應(yīng)用。M-MGIT系統(tǒng)只需要普通的培養(yǎng)箱、底部包埋有熒光物質(zhì)的4 ml MGIT培養(yǎng)管及熒光判讀儀，設(shè)備小巧方便，適合基層實(shí)驗(yàn)室使用。兩種培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)管均以7H9肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加以專用的營(yíng)養(yǎng)添加劑和雜菌抑制劑，兩者在各成分的量上有所差別。

一般認(rèn)為分枝桿菌培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，在我國(guó)各基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)在采用的培養(yǎng)法主要還是L-J法。但分枝桿菌在L-J培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，而在液體培養(yǎng)基中能快速生長(zhǎng)[8]。本研究結(jié)果也顯示，以液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)的M-MGIT和A-MGIT兩種培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)分枝桿菌的檢出率(48.7%和49.0%)明顯高于L-J培養(yǎng)法(41.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，特別是在涂陰標(biāo)本M-MGIT(31.1%)和A-MGIT(31.8%)的優(yōu)勢(shì)與L-J法(22.9%)相比更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。潘愛珍、翁繩鳳和李靜等[9-11]也報(bào)道了M-MGIT培養(yǎng)方法較L-J培養(yǎng)法在分枝桿菌檢出方面的優(yōu)越性，并且與A-MGIT方法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)于未治療患者，一般認(rèn)為涂陽(yáng)培陰率不應(yīng)超過10%，而本研究中L-J法的涂陽(yáng)培陰率達(dá)到11%，并且明顯高于M-MGIT和A-MGIT法，可能因一些患者在確診結(jié)核病之前在其他醫(yī)院經(jīng)過了廣譜抗生素的治療，致使結(jié)核分枝桿菌活力降低，再加上L-J培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)條件低于MGIT培養(yǎng)基，導(dǎo)致涂陽(yáng)培陰率升高；也有可能因在標(biāo)本液化和去污染過程中處理液加入的偏多，或時(shí)間沒掌握好，處理時(shí)間偏長(zhǎng)造成的。提示在今后工作中要注意掌握好處理液的量和處理時(shí)間。

在檢出時(shí)間方面，由L-J法的平均24 d縮短至M-MGIT和A-MGIT法的13 d和12 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，文獻(xiàn)[9-11]也報(bào)道了在分枝桿菌檢出時(shí)間方面M-MGIT法較L-J法更具有優(yōu)勢(shì)。并且兩種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株分別有51.2%和52.7%在第2周內(nèi)報(bào)告陽(yáng)性，而L-J法37.8%的菌株在第3周內(nèi)報(bào)陽(yáng)，35.5%在第4周內(nèi)報(bào)陽(yáng)。兩種液體培養(yǎng)方法與L-J法比較均顯示了良好的檢出效能，但M-MGIT與A-MGIT在檢出率和檢出時(shí)間上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。M-MGIT和A-MGIT法對(duì)分枝桿菌檢出率高且時(shí)間短，可能與前兩者的培養(yǎng)基成分和結(jié)果觀察時(shí)間間隔有關(guān)。如：液體培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分比L-J培養(yǎng)基豐富，并且其中加入了10%的CO2，由于宿主體內(nèi)的實(shí)際環(huán)境為缺氧性，使用5%～10%的CO2可能刺激分枝桿菌原代培養(yǎng)物的初期生長(zhǎng)[12]。另外，由于L-J法是1周觀察1次結(jié)果，并且通過肉眼觀察，而M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)結(jié)果觀察通過紫外線檢測(cè)熒光強(qiáng)度判斷陽(yáng)性，其結(jié)果判定更敏感，且M-MGIT法是每天監(jiān)測(cè)結(jié)果，A-MGIT法是每小時(shí)監(jiān)測(cè)結(jié)果1次，這些因素可能對(duì)M-MGIT、A-MGIT與L-J法在檢出時(shí)間上的差異產(chǎn)生影響，提示這兩種MGIT液體培養(yǎng)基比傳統(tǒng)L-J法快速、敏感。

本研究中，M-MGIT和A-MGIT培養(yǎng)法污染率分別為4.6%和4.9%，L-J培養(yǎng)法污染率為4.1%，三者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。污染率控制在我國(guó)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)2%～5%[3]之內(nèi)，污染率低于Satti等[5]和 Rodrigues等[6]報(bào)道的污染率，但高于Somosk?vi等[13]報(bào)告的污染率。各研究之間污染率差異很大，可能由于各實(shí)驗(yàn)室的痰標(biāo)本質(zhì)量、痰留存時(shí)間及運(yùn)輸條件、實(shí)驗(yàn)室條件各不相同造成。

要確定分離出的分枝桿菌是結(jié)核分枝桿菌還是非結(jié)核分枝桿菌還需進(jìn)行菌種鑒定, 培養(yǎng)陽(yáng)性的分枝桿菌中可能存在抗酸染色陽(yáng)性的非結(jié)核分枝桿菌。本研究不足之處是由于本實(shí)驗(yàn)室條件有限，未能對(duì)菌株進(jìn)行菌種鑒定, 未對(duì)M-MGIT檢出非結(jié)核分枝桿菌的能力進(jìn)行分析。

總之，M-MGIT法對(duì)分枝桿菌的檢出能力明顯優(yōu)于L-J法，與A-MGIT法相當(dāng)。但M-MGIT法的熒光判讀儀價(jià)格(8萬元人民幣左右)遠(yuǎn)低于A-MGIT法的BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(130萬人民幣左右)，因此，M-MGIT方法較A-MGIT和L-J方法在檢出分枝桿菌方面更具優(yōu)勢(shì)，在基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具有較好的應(yīng)用前景。

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