張志剛，陳建忠，歐揚(yáng)，劉平（.聊城市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東 聊城 5000；.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院藥學(xué)部，濟(jì)南 50000）

多柔比星（Doxorubicin）是腫瘤化療中常用的一種廣譜有效的抗腫瘤藥物，但其嚴(yán)重的心臟毒性效應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制。尋找對(duì)多柔比星所致心肌損傷具有保護(hù)作用、又不影響多柔比星抗腫瘤作用的藥物實(shí)為必要。有證據(jù)[1]證明，多柔比星所致心臟毒性中，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡發(fā)揮著極其重要的作用。有文獻(xiàn)[2]報(bào)道，硫辛酸（Lipoic acid，LA）可以對(duì)抗缺血再灌注腦神經(jīng)元凋亡，但是硫辛酸對(duì)多柔比星所致心肌損傷凋亡的保護(hù)作用機(jī)制，目前文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究應(yīng)用不同劑量硫辛酸對(duì)多柔比星所致大鼠心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因抑制細(xì)胞凋亡因子Bcl-2、凋亡基因Bax蛋白表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

TDK-4離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本電子公司）；垂直電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

硫辛酸（注射液，山西亞寶藥業(yè)有限公司，批號(hào):H20055869，規(guī)格:每支150 mg）；鹽酸多柔比星（注射用，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):030702，規(guī)格:每瓶10 mg）；原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒，Bcl-2、Bax多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗均由武漢博士德公司提供。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，清潔級(jí)，♂，體質(zhì)量250～280 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK（京）2006-0009。大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d。

2 方法

2.1 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和低、中、高劑量[10、20、40 mg/（kg·d）][3]硫辛酸組，每組10只。后4組腹腔注射多柔比星3 mg/kg[4]，隔日1次，連用6次建模。硫辛酸組于注射多柔比星第2天起腹腔注射相應(yīng)劑量的硫辛酸，每日1次，連用10 d。正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水10 mg/kg，隔日1次，共6次。

2.2 心肌細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)觀察

多柔比星末次給藥24 h后處死大鼠，取出心臟，取心尖部米粒大小心臟，2.5%戊二醛和1%鋨酸雙重固定，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，聚合，修塊，制成超薄組織切片，鉛鈾電子染色，透射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

每組隨機(jī)選取5個(gè)心肌標(biāo)本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片后，每個(gè)蠟塊連續(xù)2張切片，切片經(jīng)脫蠟后按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以細(xì)胞核呈棕褐色表示心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性。將切片于光鏡下放大400倍，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞核總數(shù)和凋亡細(xì)胞核數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI，%）＝凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%。

2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測(cè)心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

取待測(cè)心肌，冰預(yù)冷PBS洗滌至緩沖液清澈，加入冰預(yù)冷的組織裂解緩沖液，4℃超聲粉碎，12000 r/min離心30 min，吸取上清，分裝，－70℃保存。用Lowry法[5]測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，將各組蛋白濃度調(diào)成一致。用12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）法分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量為50 μg，電泳后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBS）沖洗，封閉，TTBS（加入吐溫20的TBS）沖洗。將膜放入Bcl-2、Bax多克隆抗體（1∶500稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜，TTBS沖洗后，將膜放入用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶500稀釋?zhuān)┲?，室溫孵?～2 h，然后用TTBS洗膜3次，每次10 min。四唑氮藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（NBT/BCIP）顯色液中避光顯色，顯色后終止反應(yīng)。將蛋白質(zhì)印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件Chem Image 5500對(duì)蛋白帶進(jìn)行灰度值（A）分析。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參蛋白，用目標(biāo)蛋白表達(dá)量的灰度值與β-actin的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列整齊，肌節(jié)明暗帶清晰，線(xiàn)粒體飽滿(mǎn)，嵴致密排列規(guī)則。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞肌絲排列疏松、紊亂，大部分肌絲呈斷裂溶解狀，線(xiàn)粒體排列紊亂、腫脹、大小不等，嵴變短變少甚至消失，大部分線(xiàn)粒體形成空泡。低劑量硫辛酸組大鼠心肌細(xì)胞部分肌絲溶解，線(xiàn)粒體排列紊亂，線(xiàn)粒體峭不清晰，局部線(xiàn)粒體空化，有空泡形成。高劑量硫辛酸組大鼠心肌細(xì)胞可見(jiàn)肌絲排列整齊，少數(shù)肌絲溶解，肌節(jié)明暗帶清晰，線(xiàn)粒體有少數(shù)空化。除中劑量硫辛酸組外的其余各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)電鏡圖見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)電鏡圖（×15000）A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.低劑量硫辛酸組；D.高劑量硫辛酸組Fig 1 Ultrastructural electron microscope of myocardial cell of rats in each group（×15000）A.normal control group；B.model group；C.LA low-dose group；D.LA high-dose group

3.2 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，低、中、高劑量硫辛酸組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of apoptosis index of myocardial cell and protein expression of Bcl-2 and Bax of rats in each group（，n＝10）

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of apoptosis index of myocardial cell and protein expression of Bcl-2 and Bax of rats in each group（，n＝10）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01；與低劑量硫辛酸組比較:▲P＜0.01；與中劑量硫辛酸組比較:◆P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01；vs.LAlow-dose group:▲P＜0.01；vs.LAmedium-dose group:◆P＜0.01

分組正常對(duì)照組模型組低劑量硫辛酸組中劑量硫辛酸組高劑量硫辛酸組ABax/Aβ-actin 0.77±0.031.40±0.03＊1.13±0.08#0.98±0.06#▲0.83±0.04#◆AI，%4.77±0.9333.40±1.23＊24.13±2.08#17.98±1.66#▲6.54±1.03#◆ABcl-2/Aβ-actin 1.50±0.100.41±0.05＊0.81±0.06#1.04±0.05#▲1.36±0.03#◆

3.3 心肌細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱，Bax蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。與模型組比較，低、中、高劑量硫辛酸組大鼠心肌細(xì)胞的Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)明顯減弱（P＜0.01），且呈劑量依賴(lài)性。各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)見(jiàn)表1，電泳圖見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)電泳圖1.正常對(duì)照組；2.模型組；3.低劑量硫辛酸組；4.中劑量硫辛酸組；5.高劑量硫辛酸組Fig 2 Electrophoretogram of protein expression of Bcl-2 and Bax in myocardial cell of rats in each group1.normal control group；2.model group；3.LA low-dose group；4.LA medium-dose group；5.LAhigh-dose group

4 討論

硫辛酸是一種很強(qiáng)的抗氧化、抗自由基的化合物，其在體內(nèi)吸收進(jìn)入細(xì)胞后，可還原成二氫硫辛酸并釋放到細(xì)胞外，還可以進(jìn)入細(xì)胞的脂相與水相部分，在任何部位清除自由基，發(fā)揮“全能抗氧化劑”的作用。有研究[6]表明，LA通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，減少活性氧的產(chǎn)生，從而抑制大鼠腦細(xì)胞的凋亡。硫辛酸可以拮抗環(huán)磷酰胺所致大鼠心肌線(xiàn)粒體酶和線(xiàn)粒體外膜的改變[7]。但是，硫辛酸對(duì)多柔比星所致大鼠心肌毒性有無(wú)保護(hù)作用，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

在本研究中，筆者建立了多柔比星致心肌細(xì)胞損傷模型。電鏡下可見(jiàn)模型組大鼠心肌細(xì)胞肌絲斷裂溶解，線(xiàn)粒體彌散腫脹，嵴排列紊亂，局部或整個(gè)線(xiàn)粒體斷裂溶解和空泡化，顯示作為心肌能量的細(xì)胞器線(xiàn)粒體功能不良，藥品的不良反應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞造成了損傷。已有研究[1]證實(shí)，在多柔比星所致心肌損傷過(guò)程中，細(xì)胞凋亡發(fā)揮著極其重要的作用，心肌細(xì)胞暴露在多柔比星中會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡，而過(guò)度的細(xì)胞凋亡會(huì)引起心功能損害。細(xì)胞凋亡在個(gè)體正常發(fā)育成熟、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及多種疾病的發(fā)生、發(fā)展的病理生理過(guò)程中具有很重要的生物學(xué)意義。凋亡加速基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2被認(rèn)為與氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[8]。Wu S等[9]用多柔比星處理培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)下降，且與多柔比星的劑量相關(guān)。促進(jìn)凋亡的Bax能與Bcl-2形成異源二聚體并通過(guò)抑制后者活性促進(jìn)凋亡發(fā)生。多柔比星通過(guò)上調(diào)Bax，使線(xiàn)粒體膜間腔的細(xì)胞色素C釋放入胞漿，啟動(dòng)凋亡程序。本實(shí)驗(yàn)中，用Western blot法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示硫辛酸保護(hù)心肌細(xì)胞的作用機(jī)制可能與增強(qiáng)心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)和抑制Bax蛋白表達(dá)有關(guān)。

[1]孫習(xí)鵬，萬(wàn)麗麗，郭澄.多柔比星心臟毒性機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2010，21（9）:853.

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[6]Antonio AM，Gillespie RA，Druse-Manteuffel MJ.Effects of lipoic acid on antiapoptotic genes in control and ethanol-treated fetal rhombencephalic neurons[J].Brain Res，2011（1383）:13.

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