馬勝超， 孫煒煒， 鞏慧慧， 馬長劍， 王菊， 田玨， 姜怡鄧

同型半胱氨酸（Hcy）濃度異常升高與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關，葉酸是Hcy代謝途徑中的重要決定因子，可減少Hcy的生成，維生素B12作為輔助因子可促進葉酸的循環(huán)利用[1]。凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）是氧化低密度脂蛋白的特異性受體，其主要功能是介導血管內(nèi)皮細胞攝取氧化低密度脂蛋白，誘導黏附分子產(chǎn)生，導致血管內(nèi)皮細胞損傷，從而加重動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[2]。但Hcy濃度異常升高引起動脈粥樣硬化發(fā)病的主要分子機制尚不明確。本研究采用人臍靜脈內(nèi)皮細胞為實驗對象，通過不同濃度的Hcy及拮抗劑葉酸和維生素B12干預后，分別對相關因子進行檢測，探討LOX-1甲基化在Hcy作用下對內(nèi)皮細胞存活作用的分子機制。

1 材料與方法

主要實驗試劑和儀器:本實驗的起始時間為2010-11至2011-08。M199培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），胎牛血清（四季清公司），胰蛋白酶，同型半胱氨酸（Sigma公司，德國），過氧化氫測試盒（南京建成公司），氧化低密度脂蛋白和脫氧核糖核酸（DNA）甲基轉(zhuǎn)移酶-1酶免試劑盒（RD公司，美國），核糖核酸（RNA）提取試劑Trizol（上海英俊生物技術公司 ），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）試劑盒（Fermentas公司，加拿大），引物由上海生工公司合成，兔抗人LOX-1抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（Santa Cruz Biotechnology.Inc公司，美國），DNA提取試劑盒（Promega公司，美國）， 實時熒光定量基因擴增儀（FTC-3000，F(xiàn)unglyn Biotech公司，加拿大）， 酶標儀和紫外凝膠成像系統(tǒng) （BIO-RAD公司，美國）。新鮮臍帶取自寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院產(chǎn)科。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及分組:按徐支芳等[3]的方法體外培養(yǎng)和鑒定原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞。將實驗組分為:①不同濃度的Hcy對人臍靜脈內(nèi)皮細胞作用組:對照組 （0μMHcy）、50 μ M Hcy組、100μ M Hcy組、200 μ M Hcy組和 500 μ M Hcy組。②拮抗劑組 : 100 μ M Hcy+30 μ M 維生素B12+ 30 μ M葉酸組，各組n均=5。各實驗組培養(yǎng)液孵育72 h，以備實驗使用。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率實驗:收集對數(shù)期的細胞，制成 5×104/mL 懸液， 按徐支芳等[3]的 3-（ 4，5）-雙甲基-2 -噻唑-（2， 5） -2苯基溴化四氮唑藍試驗方法檢測。

試劑盒測人靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)過氧化氫、氧化低密度脂蛋白和甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT-1）含量:按說明書，采用分光光度計測定過氧化氫[4]含量;酶標儀檢測氧化低密度脂蛋白[5]和DNMT-1[6]含量。

熒光定量PCR法測LOX-1和DNMT-1信使核糖核酸（mRNA）的表達: LOX-1引物:上游 : 5’-AATGATAG AAACCCTTGC-3’， 下游 :5’-TTCCCAGTTAAATGAGCC-3’；DNMT-1:上游 : 5’-GGAGCCCAGCAAG AGTA-3’，下游 : 5’-GGGAGACACCAGCCAAAT-3’;甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）:上游 :5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’， 下游 :5’-AGGGGCCACAGTCTTC-3’。 PCR反應條件: 94℃預變性 3 min， 94℃變性 45 s， 46℃（LOX-1），51℃（DNMT-1）退火 45s， 72℃延長 45 s， 擴增 50（LOX-1）、65 （DNMT-1）個循環(huán)。實驗結果根據(jù)孫艷俠等[7]的計算方法獲得目的基因的相對表達量。

蛋白免疫印跡法檢測LOX-1蛋白的表達:裂解細胞提取蛋白， BCA法[8]測蛋白濃度;取等量蛋白上樣后電泳;轉(zhuǎn)膜封閉后， LOX-1一抗（1:500）。辣根過氧化物酶（1:3000）作用1h后曝光。用Bio-Rad Quantity 4.5.2軟件分析測定其區(qū)帶的感光密度。

巢式降落式PCR法檢測LOX-1甲基化:亞硫酸鹽修飾基因組DNA。LOX-1外引物:上游:5’-TTAGTATTGTGGGAGGTTGAGGTAG-3’， 下游 :5’-TAAAATTTCACCCTTATTACCCA AA-3’。甲基化引物 :上游 : 5’-TTGAAAATATAAAATAATTAGTCGG-3’，下游 : 5’-TAAATTACAATAA CATAATCTCG-3’，產(chǎn)物長度137 bp;非甲基化引物: 上游:5’-TTGAAAATATAAAATAATTAGTTGG-3’，下游 : 5’-AAT AAATTACAATAACATAATCTCAAC-3’， Tm 42℃，產(chǎn)物長度139 bp。PCR反應條件、結果檢測與判斷按姜怡鄧等[9]方法進行。計算公式:甲基化%=甲基化（OD值）/ [甲基化（OD值）+非甲基化（OD值）]×100%。

2 結果

同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響:人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率降低與不同濃度的同型半胱氨酸作用時間呈依賴關系， 其中100、200、500μM Hcy組在Hcy作用24 h、48 h和72 h后與對照組比較，人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率均降低，500 μ M Hcy組72 h較24 h降低，上述差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.001）。表1

表1 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響 [()%，n=5]

表1 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞存活率的影響 [()%，n=5]

注:與對照組比較*P＜0.05 **P＜0.001；與本組24h比較ΔP＜0.05

?

同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中氧化低密度脂蛋白和過氧化氫含量的影響 :氧化低密度脂蛋白和過氧化氫含量隨Hcy濃度的增加而增加，呈量-效依賴關系，其中100、200、500 μM Hcy組的氧化低密度脂蛋白和過氧化氫的含量比對照組均增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。表2

表2 同型半胱氨酸 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)氧化低密度脂蛋白和過氧化氫含量的影響 （ ，n=3）

表2 同型半胱氨酸 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)氧化低密度脂蛋白和過氧化氫含量的影響 （ ，n=3）

注:與對照組比較*P＜0.05 **P＜ 0.001。OX-LDL: 氧化低密度脂蛋白H2O2: 過氧化氫 Hcy:同型半胱氨酸

?

同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中DNMT-1含量和mRNA表達的影響:DNMT-1的含量和mRNA表達隨Hcy濃度的升高而降低，其中100、200和500μM Hcy組與對照組比較，DNMT-1的含量和mRNA表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。表 3

表3 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中DNMT-1含量和mRNA表達的影響（ ，n=3）

表3 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中DNMT-1含量和mRNA表達的影響（ ，n=3）

注:與對照組比較**P＜0.001。 DNMT-1: 甲基轉(zhuǎn)移酶-1 mRNA:信使核糖核酸 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶 Hcy:同型半胱氨酸

分組 DNMT-1含量（U/L） DNMT-1 mRNA相對GAPDH表達量對照組 6.08±0.43 0.70±0.2650 μ M Hcy組 5.37±0.14 0.45±0.03100 μ M Hcy組 4.55±0.40** 0.12±0.02**200μ M Hcy組 4.17±0.60 ** 0.09±0.01**500 μ M Hcy組 3.13±0.26 ** 0.05±0.01 **拮抗劑組 5.44±0.10 0.56±0.03

同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1 mRNA和蛋白表達的影響 : LOX-1 mRNA相對GAPDH表達量隨Hcy濃度的增加而增多，其中100、200和500 μ M Hcy組與對照組比較，LOX-1 mRNA相對GAPDH表達量 及LOX-1 蛋白相對β-肌動蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。圖1，表4

圖1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1蛋白表達圖 LOX-1:凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1 β-actin:β-肌動蛋白 1: 對照組 （0μ M Hcy）,2: 50μ M Hcy組 3: 100μM Hcy組 4: 200μ M Hcy組 5: 500μ M Hcy組 6:100μ M Hcy+30μM維生素B12+ 30μ M葉酸組

表4 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1蛋白和mRNA表達以及LOX-1基因甲基化改變的影響 （ ，n=3）

表4 同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1蛋白和mRNA表達以及LOX-1基因甲基化改變的影響 （ ，n=3）

注:與對照組比較 **P＜0.001。余注見表3 圖1

分組 LOX-1 mRNA相對GAPDH表達量LOX-1基因甲基化改變 （%）對照組 0.487±0.028 0.056±0.014 0.587±0.00450μM Hcy 組 0.559±0.048 0.139±0.031 0.571±0.009100μM Hcy組 0.609±0.019** 0.288±0.055** 0.553±0.006**200μM Hcy組 0.658±0.030** 0.575±0.150** 0.542±0.009**500μM Hcy組 0.693±0.033** 0.949±0.067** 0.530±0.006**拮抗劑組 0.577±0.043 0.113±0.010 0.570±0.008 LOX-1 蛋白相對β-肌動蛋白表達量

同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1甲基化改變的影響: LOX-1甲基化程度隨Hcy濃度的增高而降低， 其中100、200和500μM Hcy組與對照組比較，LOX-1基因甲基化程度降低， 差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。 圖 2，表 4

圖2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細胞中LOX-1基因甲基化擴增產(chǎn)物電泳圖。M:甲基化 U:非甲基化。余注見圖2

3 討論

循證醫(yī)學證據(jù)表明，Hcy是動脈粥樣硬化重要的獨立危險因子。已報道的Hcy促進血管損害的可能機制包括:造成脂質(zhì)和內(nèi)皮細胞的氧化損傷;促進血栓的形成;誘發(fā)胰島素抵抗;抑制內(nèi)皮源性一氧化氮的生成[10]等。但Hcy引起動脈粥樣硬化的發(fā)病機制并不完全清楚，Hcy如何引起動脈粥樣硬化及如何防治仍是國內(nèi)外學者研究的熱點。

活性檢測結果顯示，不同濃度的Hcy作用于人臍靜脈內(nèi)皮細胞24h、48h、72h后，細胞活性顯著降低，尤以72h受損顯著，說明Hcy對內(nèi)皮細胞有損傷作用，從而導致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，此結果與胡允兆等[11]的結論一致 ，也表明本課題采用不同濃度的Hcy作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞72h使其受損，復制細胞模型是成功的。

Hcy是體內(nèi)一碳單位代謝的中間產(chǎn)物，參與甲基轉(zhuǎn)移的代謝，其異常升高會干擾DNA的甲基化修飾，該代謝途徑的異常很可能是Hcy致動脈粥樣硬化的關鍵環(huán)節(jié)之一。甲基化作為表遺傳學的重要內(nèi)容，不改變DNA 的序列，對基因的表達與沉默起重要的調(diào)節(jié)作用，通常甲基化程度和基因表達活力呈負相關[12]。LOX-1是介導內(nèi)皮細胞對氧化低密度脂蛋白等促炎物質(zhì)的攝取和降解的主要受體，是誘導氧化應激、干擾內(nèi)皮一氧化氮合成，以致激活內(nèi)皮細胞炎癥反應的重要物質(zhì)[13]。本文結果顯示LOX-1甲基化程度降低，主要原因可能是Hcy是甲硫氨酸循環(huán)中的一個關鍵調(diào)控點，由于Hcy的增加以及DNMT-1表達的降低所致的甲基轉(zhuǎn)移減少導致了此循環(huán)異常，從而使LOX-1甲基化程度降低，其具體機制有待進一步研究，而本文結果提示Hcy組中LOX-1 mRNA及蛋白的表達增高，而加入拮抗劑葉酸和維生素B12有拮抗Hcy的作用，進一步證明了Hcy引起LOX-1低甲基化是引起內(nèi)皮細胞損傷重要機制。

為了探討Hcy引起甲基化水平改變的機制，我們檢測了各組內(nèi)皮細胞中氧化低密度脂蛋白和過氧化氫含量。氧化低密度脂蛋白和過氧化氫是氧化應激的兩個重要指標，一方面，LOX-1是氧化低密度脂蛋白的受體， 氧化低密度脂蛋白可激活LOX-1使其表達增多，導致內(nèi)皮細胞損傷，另一方面，Hcy結構中存在巰基，易發(fā)生自身氧化生成過氧化氫等，因此，我們推測Hcy很可能通過活性氧簇以及所形成的氧化應激引起甲硫氨酸循環(huán)代謝異常，從而導致LOX-1甲基化改變，介導內(nèi)皮細胞損傷， 氧化低密度脂蛋白和過氧化氫表達量的增加可能是引起基因甲基化重要機制之一，仍有待進一步研究。

綜上所述，Hcy引起內(nèi)皮細胞損傷與過氧化氫、氧化低密度脂蛋白、DNMT-1和LOX-1等的表達密切相關，其中LOX-1 甲基化起了重要的作用，是引起內(nèi)皮細胞損傷又一重要機制。本文對甲基化的深入研究可能會為動脈粥樣硬化的防治提供一個新的思路。

[1] Taban-Shomal O, Kilter H, Wagner A et al.The cardiac effects of prolonged vitamin B12and folate deficiency in rats . Cardiovasc Toxicol, 2009, 9 : 95-102.

[2] Koh JM, Lee YS, Kim YS, et al. Homocysteine enhances bone resorption by stimulation of osteoclast formation and activity through increased intracellular ROS generation.J Bone Miner Res, 2006, 21 :1003-1011.

[3] 徐支芳,于海嬌,馬琳娜,等.TLR4/NF-ΚB信號通路在同型半胱氨酸致內(nèi)皮細胞損傷中的作用研究. 重慶醫(yī)科大學學報,2011,36 :1409-1412.[4] Zafari AM, Ushio-Fukai M, Akers M, et al.Role of NADH /NADPH oxidase-derived H2O2in angiotensinIIinduced vascular hypertrophy.Hypertension,1998,32:488-495.

[5] 李 飛,王景峰,聶如瓊,等. Ox-LDL對巨噬細胞Toll樣受體和炎癥反應的影響以及GW1929的干預作用.中國病理生理雜志,2008,24 :909-914.

[6] Zhao Q,Rank G,Tan YT, et al. PRMT5-mediated methylation of histone H4R3 recruits DNMT3A, coupling histone and DNA methylation in gene silencing. Nat Struct Mol Biol,2009,16:304 -311.

[7] 孫艷俠,王國干,催小岱,等. 曲美他嗪對病毒性心肌炎小鼠的保護作用及其機制. 中國循環(huán)雜志,2012,27 :224-227.

[8] 袁曉晨,劉乃豐,嚴金川,等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ對糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠血管平滑肌細胞增殖的作用.中國心血管病雜志,2005,33 :940-944.

[9] 姜怡鄧,孫煒煒,馬長劍,等. LDLR啟動子區(qū)DNA甲基化調(diào)控同型半胱氨酸致平滑肌細胞增殖的作用機制. 基礎醫(yī)學與臨床,2012,32 :245-250.

[10] 鄭平,劉學文,祁哲,等.別嘌呤醇對同型半胱氨酸和低密度脂蛋白協(xié)同損傷血管內(nèi)皮細胞的保護作用.中國循環(huán)雜志,2005,20 :172-175.

[11] 胡允兆,董吁鋼,翟玉鋒,等.辛伐他汀對同型半胱氨酸誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞的毒性和炎癥反應的影響.中華醫(yī)學雜志.2006,86:2297-2300.

[12] Yu X,Ling W, Mi M. Relationship of impairment induced by intracellular S-adenosylhomocysteine accumulation with DNA methylation in human umbilical vein endothelial cells treated with 3-deazaadenosine. Int J Exp Pathol, 2009,90 :638-648.

[13] Zhu WG,Li S,Lin LQ,et al.Vascular oxidative stress increases dendritic cell adhesion and transmigration induced by homocysteine.Cell Immunol,2009,254 :110-116.