徐晤，王志榮，李思召，張超群，李飛，周召峰，張卓琦

心房顫動是常見病和多發(fā)病，嚴重危害著公眾健康，花費較多[1]。目前心房顫動的藥物治療不盡理想，對于心房顫動發(fā)生和預防的研究，具有很重要的臨床意義。心房顫動時存在的心房重構包括電重構和結構重構，同時伴有腎素－血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的激活[2]。本實驗通過快速右心房起搏構建豬的心房顫動模型，觀測心房顫動時心房結構重構和心房肌組織中膠原蛋白-I和血管緊張素轉換酶2（ACE2）的表達及其變化，探討它們之間的關系。

1 材料與方法

實驗動物:實驗時間2010-01至2011-06，健康小型家豬18只，雌雄不限（所有的動物均由徐州醫(yī)學院動物實驗中心提供），3～4個月齡，體重（37.4±2.5）kg。先行編號，按隨機數(shù)字表隨機均分成3組，每組6只:正常對照組，植入電極不起搏；快速起搏組，植入電極并快速右心房起搏；替米沙坦組，快速右心房起搏并給予替米沙坦60mg/（kg·d）喂養(yǎng)。

模型制備:本實驗參考Chen等[3]采用的方法并加以改良以快速右心房起搏建立心房顫動模型。簡述之，以3%戊巴比妥鈉麻醉，采用Seldinger血管穿刺技術穿刺右側頸內靜脈，3組植入心房單極起搏電極(美國Medtronicstreamline)，用起搏分析儀測量起搏參數(shù)滿意（電壓閾值＜1 V，阻抗500～1000 Ω）后，連接實驗高頻心臟起搏器并埋置于右側鎖骨上區(qū)。

參數(shù)設定:起搏方式為AOO，脈沖頻率520次/分，脈沖幅度≥5 V，脈沖寬度0.15 ms，經(jīng)磁鐵啟動并測試滿意后埋置起搏器。術后予頭孢唑啉鈉3.0 g肌肉注射抗感染4天，每日觀察豬的進食進水情況，特別注意起搏器植入部位有無滲血、血腫、皮膚破潰。持續(xù)起搏2周，每周記錄一次標準肢體導聯(lián)心電圖檢查起搏狀態(tài)。

心房顫動的誘導及持續(xù)時間的觀察:各組于實驗開始及2周結束時均行電生理檢查:經(jīng)高位右心房電極行期前程序刺激和短陣快速（Burst）刺激進行心房顫動的誘發(fā)。①期前程序刺激的驅動周長(S1S1)為300 ms，S1S2間期為心房有效不應期加上50 ms，步長5 ms反掃直至不應期。如果不能誘發(fā)心房顫動則引入S3， S2S3間期從S1S2的80%開始，步長5 ms反掃直至S3落入不應期，若仍不能誘發(fā)心房顫動則引入S4。②若S4也未能誘發(fā)心房顫動，則采用12 Hz，脈寬2 ms， 4倍閾值的短陣快速刺激（l0 s）誘導，記錄刺激時心房顫動誘發(fā)的情況及持續(xù)時間。參照既往文獻[4]，把持續(xù)時間大于15 min的心房顫動定義為持續(xù)性心房顫動。如果實驗過程中出現(xiàn)持續(xù)不能自行終止的房性心動過速或心房顫動，觀察45 min后如不能自動恢復則進行電轉復，復律后暫停30 min再重新進行刺激。

超聲測量豬心室收縮末期左心房面積（LAESA）、右心房面積（RAESA）:檢查前用磁鐵關閉起搏器，使用便攜式超聲機（Philips，美國），探頭的頻率為2～4 MHz，分別在起搏前及起搏2周后采用面積—長度法測量LAESA、RAESA，測量參數(shù)取3個心動周期的平均值。

形態(tài)學觀察:取豬心肌組織數(shù)塊，置10%中性福爾馬林溶液固定，梯度酒精系列脫水， 常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm厚，并行蘇木素伊紅（HE）染色、馬松（Masson）染色和免疫組化染色。按照公司試劑說明操作，光鏡下觀察心肌細胞形態(tài)、膠原纖維及其ACE2，拍片，掃描，采用圖像分析儀定量心肌組織膠原及ACE2含量。

ACE2和膠原蛋白-I的蛋白質印跡法（Westen blot）檢測:100mg心房肌組織加0.5ml裂解液，超聲粉碎后勻漿，離心后lowry法測蛋白濃度。取40 μg總蛋白聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳（80 V 20～30 min，120 V 1～1.5 h），轉膜（10 V，1.5 h），封閉非特異抗原，分別加入膠原蛋白-I和ACE2抗體4℃過夜，再加二抗37℃ 2 h；漂洗、顯色、光密度掃描分析光密度，分別計算ACE2和膠原蛋白-I相對含量。

獲得的目標蛋白條帶OD值與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GADPH）條帶OD值相比獲得數(shù)據(jù)。GADPH是參與糖酵解的一種關鍵酶，由4個30～40 KD的亞基組成，分子量146 KD，檢測條帶大約在36 KD。

統(tǒng)計學方法:使用SPSS 16.0統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組內的前后比較用配對的t檢驗；多組比較采用單因素方差分析（ANONA），組間的兩兩比較用q檢驗（SNK法），兩計量資料相關性檢驗采用Pearson相關分析；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 豬心房顫動模型的建立及心房顫動的誘發(fā)

起搏前，3組豬程序刺激和Burst（500次/分）刺激均未誘發(fā)出心房顫動。快速起搏組和替米沙坦組快速起搏2周后關閉起搏器，快速起搏組有1只豬表現(xiàn)為持續(xù)的心房顫動，另外5只豬用程序刺激或Burst刺激均可誘發(fā)出心房顫動，心房顫動誘發(fā)率為100%，快速起搏組有5只豬可誘發(fā)超過15 min的心房顫動，平均時間（26.41±9.89）min。替米沙坦組有4只豬誘發(fā)出＜15 min的心房顫動，平均時間（9.57±2.50）min，2只豬未誘發(fā)出來心房顫動；替米沙坦組與快速起搏組比較心房顫動持續(xù)時間縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.01）。正常對照組誘發(fā)情況同術前無變化。

2.2 起搏前后心臟超聲結果（表1）

表1 實驗前后各組心臟超聲結果(mm2，)

表1 實驗前后各組心臟超聲結果(mm2，)

注:與正常對照組比較＊P＜0.05，與快速起搏組比較△P＜0.05，與同組起搏前比較▲P＜0.05

組別 心室收縮末期左心房面積 心室收縮末期右心房面積起搏前 起搏2周后 起搏前 起搏2周后正常對照組 569.8±16.6 572.4±17.1 495.5±19.9 498.7±18.3快速起搏組 573.1±14.9 744.3±29.9＊ 497.9±12.2 677.9±26.3＊替米沙坦組 571.4±21.1 630.6±10.9＊△▲ 499.1±29.3 553.4±13.7＊△▲只數(shù)666

起搏前后使用美國SONOHEART便攜式超聲機測量LAESA、RAESA。起搏前，3組LAESA和RAESA分別比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；起搏2周后，快速起搏組和替米沙坦組LAESA和RAESA均較正常對照組大（P＜0.05），替米沙坦組LAESA和RAESA均較快速起搏組縮小（P＜0.05），替米沙坦組LAESA和RAESA起搏2周后較起搏前增大（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

2.3 形態(tài)學觀察

豬右心房組織形態(tài)學觀察結果:蘇木素伊紅染色（圖1）顯示，快速起搏組心肌細胞排列紊亂，組織結構破壞，可見明顯的間質纖維化。替米沙坦組較快速起搏組明顯好轉，心肌細胞排列較規(guī)整，細胞核較規(guī)則，可見少量纖維組織填充。馬松染色（圖2）顯示，替米沙坦組心房肌組織膠原陽性染色較快速起搏組明顯減少，主要位于血管周圍和心肌細胞間質。

2.4 血管緊張素轉換酶2免疫組化染色（圖3）

圖1～3 豬右心房組織形態(tài)學觀察結果。1為蘇木素伊紅染色 2為馬松染色 3為血管緊張素轉換酶2免疫組化染色。A為正常對照組 B為快速起搏組 C為替米沙坦組

正常對照組心房肌ACE2陽性顆粒較多，快速起搏組心房顫動心房肌陽性染色明顯減少，替米沙坦組予替咪沙坦干預后心房肌ACE2陽性顆粒明顯增多。

2.5 血管緊張素轉換酶2和膠原蛋白-I 的蛋白質印跡法結果

快速起搏組ACE2含量明顯低于正常對照組、替米沙坦組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義（圖4）。快速起搏組膠原蛋白-Ⅰ含量明顯高于正常對照組、替米沙坦組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義（圖 5）。

圖4 、圖5 蛋白質印跡法結果。4為血管緊張素轉換酶295 KD 5為膠原蛋白-I 90 KD。A為正常對照組 B為快速起搏組 C為替米沙坦組

2.6 Pearson 相關分析

RAESA與膠原蛋白-I呈正相關（r=0.956，P＜0.01），RAESA與ACE2、ACE2與膠原蛋白-I均呈負相關（r=-0.966，r=-0.948，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。

3 討論

通過快速右心房起搏建立持續(xù)性心房顫動模型。既往有應用乙酰膽堿等藥物及造成二尖瓣反流等建立的心房顫動模型，但不能模擬心房顫動真實發(fā)病過程及特點。本實驗以Chen等[3]的方法為基礎加以改良，采用閉胸法通過快速右心房起搏建立持續(xù)性心房顫動豬動物模型，更接近心房顫動的病理生理狀態(tài)。右心房以500次/分的起搏頻率起搏2周后，觀察到1只豬出現(xiàn)持續(xù)性心房顫動；經(jīng)程序刺激或Burst刺激，心房顫動誘發(fā)率可達100%，其中快速起搏組83.3%的豬可誘發(fā)出持續(xù)時間＞15 min的心房顫動。該方法操作簡便、成功率高、可重復性好，為進一步實驗奠定了基礎。

心房顫動時心房病理形態(tài)學變化及結構重構。在沒有電重構、心房擴張和心力衰竭的情況下，單純的心房纖維化足以促進心房顫動的發(fā)生[5]。賈紅丹等[6]發(fā)現(xiàn)風濕性心臟病伴慢性心房顫動患者心房結構重構以心肌纖維化為主要特征，心房顫動患者左、右心房血管緊張素Ⅱ受體表達不平衡，且較竇律者組有升高趨勢。本實驗病理形態(tài)學顯示，心房顫動模型心肌細胞排列紊亂，組織結構破壞，可見明顯的間質纖維化以及脂肪組織浸潤，間質膠原沉積，各型膠原比例失調和排列紊亂，這些病理學改變?yōu)樾姆款潉拥陌l(fā)生和持續(xù)提供了病理生理方面的物質基礎，快速心房起搏會導致心房的進行性擴大。

心房顫動時腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活及心房纖維化，替米沙坦干預對心房顫動時心房結構重構的影響。腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活在心房顫動心房間質纖維化的發(fā)生中起重要作用[7]。在心肌梗死后的心室肌內，血管緊張素Ⅱ1型受體（AT1）受體阻滯劑氯沙坦、奧美沙坦恢復了血管緊張素Ⅱ1型受體的正常表達，同時增加了ACE2的表達[8]。ACE2的表達能部分抵抗血管緊張素 II誘導的心肌肥厚和纖維化[9]。我們前期研究結果示[10]:替米沙坦可提高慢性心房顫動心房ACE2的表達，抑制慢性心房顫動的心房纖維化。本結果顯示豬經(jīng)過快頻率心房起搏2周后，心房顫動的誘發(fā)率顯著增加，并且持續(xù)時間明顯延長；病理學證實發(fā)生了明顯間質纖維化?？焖傩姆科鸩T導的豬心房顫動模型的心房組織的ACE2表達下降可能是導致膠原蛋白-I表達增加、心房纖維化的重要機制之一。替米沙坦能有效降低心房纖維化，抑制豬慢性心房顫動模型結構重構的發(fā)生，進而為替米沙坦治療心房顫動提供了新的理論依據(jù)。

[1] Naccarelli GV, Johnston SS, Lin J, et al. Cost burden of cardiovascular hospitalization and mortality in ATHENA-like patients with atrial fibrillation/atrial flutter in the United States. Clin Cardiol，2010，33:270-279.

[2] Healey JS, Morillo CA, Connolly SJ. Role of the renin-angiotensinaldosterone system in atrial fibrillation and cardiac remodeling. Curr Opin Cardiol， 2005,20:31-37.

[3] Chen CL, Lin JL, Lai LP, et al. Altered expression of FHL1, CARP,TSC-22 and P311 provide insights into complex transcriptional regulation in pacing-induced atrial fibrillation. Biochim Biophys Acta，2007, 1772: 317-329.

[4] Laurent G, Moe G, Hu X, et al. Experimental studies of atrial fibrillation: a comparison of two pacing models. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294:H1206-1215.

[5] Schotten U, Verheule S, Kirchhof P, et al. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiol Rev，2011，91:265-325.

[6] 賈紅丹，李曦銘，李作成，等. 風濕性心臟病伴發(fā)心房顫動及竇性心律患者血管緊張素Ⅱ受體在左、右心房中的不平衡表達. 中國循環(huán)雜志，2010，25:201-204.

[7] Li Y, Li W, Yang B, et al. Effects of Cilazapril on atrial electrical,structural and functional remodeling in atrial fibrillation dogs. J Electrocardiol， 2007，40:100.

[8] Ishiyama Y, Gallagher PE, Averill DB, et al. Upregulation of angiotensin -converting enzyme 2 after myocardial infarction by blockade of angiotensin II receptors. Hypertension, 2004,43:970-976.

[9] Keidar S, Kaplan M, Gamliel-Lazarovich A. ACE2 of the heart:From angiotensin I to angiotensin (1-7). Cardiovasc Res，2007,73:463-469.

[10] 譚偉，張超群，徐晤，等. 血管緊張素轉換酶2 在心房顫動心房纖維化中的作用.中國循環(huán)雜志，2011，26:306-309.