史久煜 浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院消化科 寧波 315040

呂 賓 浙江中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化科

云母對NSAIDs相關性小腸黏膜損傷COX-2及HSP70表達的影響

史久煜 浙江省寧波市鄞州人民醫(yī)院消化科 寧波 315040

呂 賓 浙江中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化科

目的：研究NSAIDs相關性小腸黏膜損傷COX-2及HSP70表達，探討云母對小腸黏膜的保護機制。方法：24只SD大鼠，隨機分為對照組、模型組、云母組，每組8只。模型組和云母組每天予雙氯酚酸鈉溶液7.8mg/（kg·d）劑量灌胃，制備大鼠NSAIDs相關性小腸黏膜損傷模型，云母組每天造模前予云母液120mg/（kg·d）劑量灌胃。灌胃給藥5天后處死大鼠，進行大體形態(tài)觀察，腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）及病理Chiu氏評分；免疫組化法檢測小腸黏膜COX-2及HSP70表達。結(jié)果：與對照組比較，模型組CMDI、Chiu氏評分及COX-2、HSP70表達水平明顯升高（P＜0.01）。而云母組CMDI、Chiu氏評分及COX-2表達水平較模型組有明顯下降（P＜0.01），HSP70水平更進一步升高（P＜0.01）。結(jié)論：NSAIDs相關性小腸黏膜損傷與COX-2及HSP70表達有關，云母可抑制損傷小腸黏膜COX-2表達，同時增強HSP70表達，從而對小腸黏膜起到保護作用。

大鼠 腸黏膜損傷 NSAIDs雙氯酚酸鈉 云母 COX-2 HSP70

非甾體抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是一類具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用的藥物，臨床應用極為廣泛，但在服用時可引起胃腸黏膜損傷。藥用云母為白云母，主要成分為二氧化硅和氧化鋁?！吨腥A藥海》[1]記載云母“截瘧止痢、止血斂瘡和溫虛補腎”?！吨袊V物藥圖鑒》[2]記錄“主下痢腸癖，補腎冷”。文獻[3]報道，云母具有選擇性吸附作用和加強消化道黏膜屏障保護作用。本實驗通過測定NSAID相關性小腸黏膜損傷COX-2及HSP70的表達，探討云母的腸黏膜保護作用。

1 實驗材料

1.1 動 物 雄性SPF級Wistar大鼠共24只，體質(zhì)量280～300g，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2008-011。

1.2 藥物及試劑 雙氯酚酸鈉腸溶片（商品名：扶他林，國藥準字H11021640，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)），云母粉（產(chǎn)地河北，購于浙江中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房）分別用0.9%生理鹽水配置成0.78mg/ mL、12mg/mL濃度的均勻溶液，并參照成人口服常規(guī)劑量折算成大鼠灌胃用量。HSP70 RB-080PO、COX-2 RB-9072PO為兔來源的多克隆抗體（美國labvision Neomarkern公司產(chǎn)品），山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（Lot：00001360），DAB顯色液（DAKO，Lot：00029661）。

2 實驗方法

2.1 大鼠腸黏膜損傷模型建立 24只大鼠完全隨機分為對照組、模型組和云母組，每組8只，適應1周后開始實驗。對照組予0.9%生理鹽水1mL/（100g· d）劑量灌胃，后兩組予雙氯酚酸鈉溶液7.8mg/（kg· d）劑量灌胃，制備小腸黏膜損傷模型，共5天。其中云母組在每次雙氯酚酸鈉溶液灌胃30min前，先予云母溶液按120mg/（kg·d）的劑量灌胃保護。

2.2 標本制備 灌胃5天結(jié)束后，禁食不禁水，于次日腹腔注射5%丙戊酸鈉溶液麻醉大鼠，將其仰臥固定于手術臺，沿腹部正中切開，分離小腸組織，沿腸系膜縱軸剪開，用冰生理鹽水沖洗凈，肉眼觀察大體形態(tài)，取病變最明顯處組織置于10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

2.3 檢測指標

2.3.1 一般情況和大體形態(tài) 觀察大鼠在實驗過程中有無死亡（死亡大鼠進行尸解查明原因），精神狀態(tài)，活動情況，食欲，大便（有無血便、腹瀉、大便次數(shù)增多等）和體質(zhì)量改變等情況。取小腸黏膜組織肉眼觀察大體形態(tài)并進行腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分，評分標準[4]：0分：無損傷；1分：輕度充血、水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍；2分：充血水腫，黏膜粗糙呈顆粒狀，有糜爛或腸黏連；3分：高度充血水腫，黏膜表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍最大縱徑＜1.0cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥；4分：在3分基礎上潰瘍最大縱徑＞1.0cm，或全腸壁壞死。

2.3.2 病理組織學檢測 取病變較明顯的小腸黏膜包埋切片，HE染色，鏡下評價病變黏膜，并進行Chiu氏[5]法評分：0分：正常；1分：絨毛頂端上皮下間隙增寬；2分：絨毛頂端上皮下間隙進一步擴大，絨毛尖端上皮抬高與固有膜剝離；3分：絨毛上皮成塊脫落；4分：上皮完全脫落，僅有固有膜；5分：固有膜層崩裂，出現(xiàn)出血與潰瘍。

2.3.3 COX-2及HSP70表達測定 操作步驟：石蠟切片，二甲苯脫蠟、無水乙醇、95%、80%、70%乙醇至水化；蒸餾水洗；抗原修復：COX-2、HSP70采用高溫高壓修復（0.01M檸檬酸緩沖溶液，pH：6.0），時間為100s；餾水洗，PBS 5min×3次；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min；PBS洗5min×3次；滴加適當比例稀釋的一抗，4℃過夜。（COX-2 RB-9072PO工作濃度1：75；HSP70 RB-080PO工作濃度1：50，均為兔來源的多克隆抗體，用PBS代替一抗為實驗空白對照）；PBS沖洗，5min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體（Lot：00001360），37℃孵育40min；PBS沖洗，5min×3次；DAB顯色液（DAKO，Lot：00029661）顯色1～3min，顯微鏡下控制反應，自來水沖洗終止反應；Harris蘇木素液復染細胞核1min，95%、100%乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。高倍顯微鏡（10×20）下觀察，計分標準:①陽性染色細胞數(shù)占視野細胞總數(shù)的多少計分為A：無陽性染色細胞為0分；陽性細胞百分數(shù)＜25%為1分；25%～50%為2分；＞50%為3分。②按著色細胞染色強度計分為B：細胞呈陰性染色為0分；染色弱，陽性細胞呈淡黃色為1分；染色中等，陽性細胞呈棕黃色為2分；染色強，陽性細胞呈棕褐色為3分。以A+B值作為判斷結(jié)果，進行統(tǒng)計分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 使用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 一般情況和大體形態(tài)觀察 實驗期間對照組大鼠一般情況良好，體質(zhì)量無減輕，無腹瀉、血便，無死亡，精神、活動正常，解剖示腸黏膜正常，無充血水腫糜爛等。模型組大鼠于灌胃第1、2天出現(xiàn)驚恐，煩躁不安等癥狀；第3天開始大鼠精神極度萎靡，活動減少，食欲明顯減退,毛發(fā)雜亂，大便變稀，體質(zhì)量減輕10～20g不等，至灌胃第4、5天，陸續(xù)有大鼠死亡，分別死亡2只和3只，尸檢顯示小腸黏膜多處重度糜爛壞死及腸穿孔粘連，考慮腸穿孔死亡。余存活模型組大鼠解剖示小腸黏膜明顯充血水腫、糜爛，但未見腸穿孔。云母組大鼠精神狀況較正常組稍差，活動，食欲一般，大便正常，體質(zhì)量未見明顯變化，實驗期間無大鼠死亡。解剖示小腸黏膜較完好，僅見輕度充血水腫。三組大鼠胃黏膜大體形態(tài)均未見充血水腫糜爛等損傷。各組大鼠小腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評分比較，模型組CMDI評分較對照組明顯升高（P＜0.01），云母組大鼠CMDI評分均較模型組有明顯下降（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠小腸黏膜損傷指數(shù)評分比較 只

3.2 病理觀察 高倍鏡（10×20）下觀察所有大鼠胃黏膜未見明顯病理變化。對照組大鼠小腸黏膜正常，無充血水腫糜爛等；模型組大鼠小腸黏膜上皮細胞層部分變性壞死、脫落，充血糜爛，炎癥細胞浸潤；云母組大鼠小腸黏膜較完好，輕度充血水腫。各組大鼠小腸黏膜病理Chiu氏評分比較，其中模型組小腸黏膜病理Chiu評分較對照組明顯升高（P＜0.01），云母組小腸黏膜病理Chiu評分較模型組明顯降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠小腸黏膜病理Chiu氏評分比較 只

3.3 云母對COX-2表達的影響 顯微鏡下觀察陰性細胞核呈藍色，陽性為黃色或黃棕色。其中COX-2主要以在腸組織的上皮細胞胞漿內(nèi)表達為主，但固有層內(nèi)的炎癥細胞也有少量表達，HSP70的表達主要在腸組織的上皮細胞和固有層內(nèi)的炎癥細胞，陽性定位于細胞漿或胞核內(nèi)。與對照組比較，模型組COX-2表達水平明顯增強（P＜0.01），云母組COX-2表達水平較模型組明顯下降（P＜0.01）。見表3、圖1（插頁）。

表3 各組大鼠小腸黏膜組織COX-2表達比較 只

3.4 云母對HSP70表達的影響 造模后大鼠小腸黏膜HSP70表達較對照組明顯增強（P＜0.01），而云母組小腸黏膜HSP70表達進一步增強（P＜0.01）。見表4、圖2（插頁）。

4 討論

由于檢查手段的限制，以往對NSAIDs引起的小腸黏膜損害了解較少。隨著膠囊內(nèi)鏡（VCE）和雙氣囊小腸鏡（DBE）的不斷普及，人們發(fā)現(xiàn)，小腸較胃十二指腸更易受到NSAIDs的損害。Graham等[6]對慢性NSAIDs服用者行膠囊內(nèi)鏡（VCE）檢查發(fā)現(xiàn)有高達71%的患者發(fā)生了小腸損傷。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)雙氯酚酸鈉溶液造模后的大鼠胃黏膜未見損傷，而小腸黏膜損傷明顯。

表4 各組大鼠小腸黏膜組織HSP70表達比較 只

COX-2在大多數(shù)細胞中低水平表達，甚至無法檢測到，但在許多病理情況下能急劇增加，被認為是一種可誘導酶，其產(chǎn)生跟炎癥和癌癥等有關。通過環(huán)氧合酶（COX）合成多種前列腺素和白三烯等炎癥介質(zhì)，產(chǎn)生紅、腫、熱、痛、充血、水腫、炎癥細胞浸潤等炎癥表現(xiàn)，影響腸管液體的轉(zhuǎn)運、腸管活動、調(diào)節(jié)免疫，使炎癥反應放大或持久化[7]。在鼠和人的病變腸黏膜中均發(fā)現(xiàn)COX-2表達異常，尤其在潰瘍邊緣明顯增多[8-9]。Hendel等[10]在結(jié)腸炎患者中發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞的COX-2上調(diào)，并且活動期患者明顯高于非活動期患者。目前認為，COX-2主要參與病理過程，病理狀態(tài)下，炎癥處COX-2表達急劇增加，尤其是在急性炎癥反應中起主要作用。但也有研究認為，COX-2并非有理論上的嚴格界限,可能對維持黏膜完整性也發(fā)揮了作用。Reuter等[11]在鼠實驗性結(jié)腸炎組織中發(fā)現(xiàn)COX-2水平增加及前列腺素合成增多，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)選擇性COX-2抑制劑處理的動物腸黏膜病變加重，甚至發(fā)生穿孔或死亡。本實驗發(fā)現(xiàn)雙氯酚酸鈉溶液灌胃后的大鼠腸黏膜COX-2水平較對照組明顯增高（P＜0.01），死亡率極高（5/8），而經(jīng)云母治療后腸黏膜損傷情況明顯好轉(zhuǎn)，COX-2表達明顯下降（P＜0.01），且無1例發(fā)生死亡，提示COX-2與腸黏膜損傷程度相關。據(jù)此認為COX-2在腸黏膜損傷的作用機制中主要參與誘導炎癥反應，從而導致腸黏膜的病理損害，而云母可抑制其表達，減輕炎癥反應，增強腸黏膜保護作用。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是生物體（或離體、培養(yǎng)細胞）在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的應激蛋白，它普遍存在于整個生物界，幾乎所有的細胞均能合成。正常情況下，HSP70表達很低，在病理狀態(tài)下表達會增強，起自我防御作用。研究表明，哺乳動物細胞HSP70的表達主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，在非應激條件下HSF（熱應激轉(zhuǎn)錄因子）是以單體形式存在，應激后HSF單體的空間構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出疏水重復序列，使HSF單體聚集成具有DNA結(jié)合能力的三聚體。在應激狀態(tài)下，HSF與變性蛋白競爭結(jié)合HSP70，當變性蛋白增多時，游離的HSF也增加，從而誘導HSP70的合成，直至HSP70的含量足夠結(jié)合HSF，使HSF處于抑制狀態(tài)。HSP70作為HSP家族中最保守最主要的一組蛋白質(zhì)，在保護腸黏膜上皮細胞方面具有重要的作用[12-14]。Galois等[15]采用基因轉(zhuǎn)染方法，使巨噬細胞過度表達HSP70，然后應用內(nèi)毒素分別刺激轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HSP70能明顯抑制iNOS、TNF-α等細胞因子的釋放，減輕炎癥反應，從而起到保護細胞的作用。Jayakumar等[16]報道腸黏膜屏障損傷引起內(nèi)毒素血癥時，HSP基因缺乏的鼠死亡率及血促炎細胞因子水平明顯高于正常鼠。本實驗發(fā)現(xiàn)云母也能促進腸黏膜HSP70的表達，增強腸黏膜保護作用。有關HSP70的研究已成為分子生物學的熱點之一，且逐漸為治療提供了新途徑[17]?？傊?，HSP70的細胞保護作用現(xiàn)已經(jīng)得到多數(shù)實驗的支持，因而在保護腸黏膜的治療中誘導細胞HSP70的表達是值得期待的方向。

綜上所述，云母能抑制損傷小腸黏膜COX-2的表達，同時增強HSP70的表達，從而促進腸黏膜的愈合，這可能是云母保護腸黏膜屏障的重要機制之一。

［1］楊松年.中國礦物藥圖鑒［M］.上海：上?？茖W技術文獻出版社，1995.

［2］冉先德.中華藥海［M］.哈爾濱：哈爾濱出版社，1993：261.

［3］管俊芳，陸琦，周湖云，等.天然礦物材料在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應用及開發(fā)［J］.礦產(chǎn)與地質(zhì)，2002，16（1）：34.

［4］Millar AD Rampton DS，Chander CL，et al.Evaluating the antioxidant potential of new treatments for inflammatory bowel disease using a rat model of colits［J］.Gut，1996，39（3）：407-415.

［5］Chiu CJ，Scott HJ，Gurd FN，et al.Intestinal mucosal lesion in low-flow states［J］.Arch Surg，1970，101（4）：484-488.

［6］Graham DY，Opekun AR，Willingham FF，et al.Visible smallintestinal mucosal injury in chronic NSAID users［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2005，3（1）：55-59.

［7］Dong WG，Lu SP，Yu BP，et al.Ameliorative effects of sodium ferulate on experimental colitis and their mechanisms in rats［J］.World J Gastroenterol，2003，9（11）：2533-2538.

［8］Kargman S，Charleson S，Cartwright M，et al.Characterization of prostaglandin G/H synthase 1 and 2 in rat，dog，monkey，and human gastrointestinal tracts［J］.Gastroenterology，1996，111（2）：445-454.

［9］Mahida YR，Beltinger J，Makh S，et al.Adult human colonic subep-Ithelialmyofibroblastsexpressextracellular matrix protein and cyclooxygenase-1 and-2［J］.Am J Physiol，1997，273（6）：G1341-G1348.

［10］Hendel J，Nielsen OH.Expression of cyclooxygenase-2 mRNA in active inflammatory bowel disease［J］.Am J Gastroenterol，1997，92（7）：1170-1173.

［11］Reuter BK，Asfaha S，Buret A et al.Exacerbation of inflammation associated colonic injury in rat through inhibition of cyclooxygenase-2［J］.JClin Invest，1996，89（9）：2076-2085.

［12］Ropeleski MJ，Tang J，Walsh-Reitz MM，et al.Interleukin-11-induced heat shock protein 25 confers intestinal epithelial-specific cytoprotection from oxidant stress［J］.Gastroenterology，2003，124（5）：1358-1368.

［13］Kojima K，Musch MW，Ropeleski MJ，et al.Escherichia coli LPS induces heat shock protein 25 inintestinal epithelial cells through MAP kinase activation［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004，286（4）：G645-G652.

［14］Ohkawara T，Nishihira J，Takeda H，et al.Protective effect of geranylgeranylacetone.on trlnitrobenzene sulfonic acidinduced colitis in mice［J］.Int J Mol Med，2006，17（2）：229-234.

［15］Galois SL，Etienn ES，Grossi NL，et al.Dose-response relationship for exercise on severity of experimental osteoarthritis in rats:a pilot study［J］.Osteoarthritis Cartilage，2004，12（10）：779-786.

［16］Jayakumar J，Suauki K，Sammut IA，et al.Heat shock protein 70 gene transfection protects mitochondrial and ventricular fucnction against ischemia-reperfusion injury［J］. Circ-Res，2004，95（4）：433-440.

［17］Westerheide SD.Morimoto RI.Heat shock response modulators as therapeutic tools for diseases of protein conformation［J］.Journal of Biology Chemistry，2005，280（39）：33097-33100.

Effects of Mica on COX-2 and HSP70 of NSAIDs-induced small intestinal damage

SHI jiuyu，LV bin.Yinzhou People's Hospital，Ningbo（315040），China

Objective：To study the effect of mica on the expression of COX-2 and HSP70 in non-steroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）-induced small intestinal damage and to approach the protective mechanism of mica.Methods：Twenty-four rats were randomly divided into control group，model group，and mica group，8 rats in each group.With the exception of rats in control group，all rats were intragastrically administered with diclofenac sodium（7.8 mg/kg）for 5 days to establish the model of NSAIDs-induced small intestinal damage.The rat in mica group were given daily intragastric administration of mica（120mg/kg）before administration of diclofenac sodium.All rats were killed on day 5.At that time,the colonic mucosal damage index（CMDI）and Chiu score were evaluated and the expression of COX-2 and HSP70 were measured by biochemical and immunohistochemical methods.Results：Compared with control group，the rat in model group had significantly increased CMDI，Chiu score，and COX-2 and HSP70（P＜0.01）.Mica treatment resulted in significantly decreased CMDI，Chiu，and COX-2，but more activities of HSP70 in comparison with model group（P＜0.01).Conclusion：NSAIDs-induced small intestinal damage was related to the expression of COX-2 and HSP70，and mica may offer protective effects against the damage by decreasing the expression of COX-2 and increasing the expression of HSP70.

rats intestinal damage NSAIDs diclofenac sodium mica COX-2 HSP70

2013-08-01

呂賓，E-mail：Lvbin@medmail.com.cn