鐘立強(qiáng)，劉朋朋，潘建林，，王明華，陳友明，秦 欽，邊文冀，陳校輝＊＊

(1:江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017)

(2:南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210097)

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是一種常見的中小型經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于長(zhǎng)江、黃河、珠江及黑龍江等各水域[1].因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、無肌間刺等特點(diǎn)，廣受消費(fèi)者歡迎，市場(chǎng)價(jià)格一度攀升，已經(jīng)成為越來越重要的特種養(yǎng)殖品種[2].

線粒體DNA (Mitochondrial DNA，mtDNA)由于其母系遺傳特點(diǎn)，復(fù)制過程中缺乏修復(fù)機(jī)制導(dǎo)致序列的累積變異速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核基因組的變異速率等特點(diǎn)，已成為群體遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育等研究的理想的分子標(biāo)記[3-4].細(xì)胞色素體b(cyt b)為mtDNA 上的蛋白質(zhì)編碼基因，進(jìn)化速度適中，適合種間到種內(nèi)水平上的系統(tǒng)發(fā)生研究，在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中有著廣泛的應(yīng)用[5-7].黃顙魚在我國(guó)各大水系均有分布，通過線粒體DNA 不同區(qū)域和基因序列對(duì)不同水系黃顙魚種群的遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化關(guān)系已經(jīng)進(jìn)行了一些研究.Watanabe 等[8]、方耀林等[9]和庫(kù)喜英等[10]分別以 mtDNA D-loop 區(qū)、ND1/2 基因和 cyt b 基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，對(duì)我國(guó)多個(gè)水系間的黃顙魚群體進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明我國(guó)各水系的黃顙魚處于中等遺傳變異水平，各水系間存在相當(dāng)?shù)幕蛄?，進(jìn)化速率相對(duì)很低.丁言偉[11]則對(duì)我國(guó)黃顙魚屬的五種黃顙魚mtDNA的ND4 基因進(jìn)行了測(cè)序分析，闡明了黃顙魚屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳變異，探討了黃顙魚屬五種魚類的種群遺傳結(jié)構(gòu)，黃顙魚的種群遺傳多樣性最小，黃顙魚現(xiàn)在的種群可能由一個(gè)單一的古老的世系動(dòng)態(tài)擴(kuò)張而來.而目前對(duì)長(zhǎng)江水系內(nèi)部不同湖泊和流域的黃顙魚遺傳結(jié)構(gòu)分析還未見報(bào)道.本研究采集長(zhǎng)江中下游鄱陽湖、巢湖、滆湖、洪澤湖、太湖5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群，通過mtDNA cyt b 基因核苷酸序列的比較分析，探討5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，期望深入了解5 個(gè)湖泊黃顙魚種群的遺傳背景和種質(zhì)資源現(xiàn)狀，以利于在黃顙魚育種中更好地發(fā)掘其遺傳潛力，為黃顙魚多性狀復(fù)合育種技術(shù)研究及新品系選育積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 研究材料

實(shí)驗(yàn)用野生黃顙魚采集于長(zhǎng)江中下游鄱陽湖、巢湖、滆湖、洪澤湖、太湖5 個(gè)湖泊，每個(gè)種群采集樣本數(shù)見表1，剪取活魚部分尾鰭，于無水乙醇中固定，放入4℃冰箱保存.

1.2 DNA提取

基因組DNA 的提取參照Sambrook 等[12]的方法.DNA 濃度、質(zhì)量用分光光度儀(Unico UV-4802H)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢.總DNA 稀釋至100 ng/μl，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?

1.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

Cyt b 擴(kuò)增和測(cè)序的引物為通用引物 L14724 和 H15915[13]，引物序列為 L14724:5’-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3’;H15915:5’-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3’，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成.

PCR 反應(yīng)體系為 50 μl:模板 DNA 50 ng;2× PCR Mix 25 μl(包含 Taq 酶 2.5 U，dNTPs 10 μmol，MgCl20.1 mmol)，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μl，其余體積用水補(bǔ)足.反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性2 min，94℃變性45 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，經(jīng)35 個(gè)循環(huán)后再72℃延伸10 min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)割膠純化后，直接送上海捷瑞生物工程有限公司利用正反引物進(jìn)行雙向測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

DNA 序列用 BioEdit 7.0.5[14]軟件比對(duì)剪切序列，MEGA 4.1 軟件[15]計(jì)算堿基含量，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.DnaSP 軟件[16]計(jì)算變異位點(diǎn)，單倍型數(shù)目、單倍型多樣性指數(shù)(h)、平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多態(tài)性(π)等，用Arlequin 3.01 軟件[17]中的Kimura 2-Parameters 方法構(gòu)建5 個(gè)湖泊種群間的相對(duì)遺傳距離，用分子方差分析(AMOVA)方法計(jì)算遺傳分化指數(shù)(Fst)并分析遺傳變異來源與組成.

2 結(jié)果

2.1 序列特征

5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群60 個(gè)個(gè)體的mtDNA cyt b 序列經(jīng)Bioedit 軟件比對(duì)剪切后，獲得長(zhǎng)度為955 bp 的同源序列，MEGA 4.1 軟件分析其堿基組成平均為 T (26.0%)、C(32.3%)、A(27.6%)、G(14.1%)，A +T含量為53.6%，略高于G+C 含量46.4%.DnaSP 軟件分析顯示，共有54 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的5.65%，單態(tài)突變位點(diǎn)(singleton variable sites)39 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(parsimony informative sites)15 個(gè);同時(shí)還檢測(cè)到43 個(gè)插入或缺失位點(diǎn)，堿基插入或缺失主要以C 或G 單核苷酸重復(fù)片段的形式進(jìn)行.按突變類型分，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)33 個(gè)，顛換位點(diǎn)17 個(gè)，轉(zhuǎn)換和顛換共存位點(diǎn)4 個(gè)，轉(zhuǎn)換和顛換之比為1.94.而不計(jì)插入/缺失部分，60 個(gè)個(gè)體中共檢出37 種單倍型序列，37 個(gè)單倍型序列GeneBank 登錄號(hào)為:JX424082 ～JX424118，種群共享的單倍型有3 個(gè)(表2).5 個(gè)種群的單倍型平均多樣性指數(shù)為0.945±0.018，平均核苷酸多樣性指數(shù)為0.00419±0.00043，各種群多樣性參數(shù)見表1.5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群中，滆湖和鄱陽湖種群的單倍型多樣性指數(shù)最高，洪澤湖種群的核苷酸多樣性指數(shù)最高，而太湖種群的單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)均為最低.

表1 5 個(gè)黃顙魚種群的單倍型及遺傳多樣性參數(shù)Tab.1 Parameter summary of haplotypes and genetic diversity of five populations of yellow catfish

表2 黃顙魚群mtDNA cyt b 序列37 種單倍型變異位點(diǎn)及其在5 個(gè)種群中的分布Tab.2 Variation sites of mtDNA cyt b of 37 haplotypes of yellow catfish and their di stribution in five populations

2.2 群體變異和遺傳結(jié)構(gòu)

將測(cè)序獲得的60 個(gè)個(gè)體的mtDNA cyt b 序列輸入Arlequin 軟件，使用Kimura 2-Parameters 方法構(gòu)建5 個(gè)湖泊種群間的相對(duì)遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Fst(表3).從遺傳距離來看，太湖種群與滆湖種群間的遺傳距離最遠(yuǎn)為0.00651，遺傳距離最近的是鄱陽湖和巢湖種群之間為0.00375.種群內(nèi)部遺傳距離從大到小依次 為:鄱 陽 湖 (0.00640) ＞ 太 湖(0.00521)＞洪澤湖(0.00461)＞巢湖(0.00446)＞滆湖(0.00377).五種群的平均遺傳分化系數(shù)Fst為 0.0684.5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群間存在顯著性遺傳變異(P ＜0.05).

為了進(jìn)一步分析種群間的相互遺傳差別，運(yùn)用Arlequin 軟件中AMOVA 分子方差分析法估算5 個(gè)種群間的遺傳變異結(jié)構(gòu)和來源.分子方差結(jié)果顯示，5 個(gè)黃顙魚種群內(nèi)具有很高的遺傳變異.種群間的變異占總變異的6.84%，而種群內(nèi)的變異對(duì)總變異的貢獻(xiàn)率達(dá)到93.16%(表4)，群體內(nèi)未出現(xiàn)遺傳分化.分析單倍型數(shù)據(jù)所得遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.01992，基因流 Nm 為 12.30;而 60 個(gè)個(gè)體的 Gst為0.13441，基因流 Nm 為1.61.

表3 5 個(gè)黃顙魚種群間K 2-P 遺傳距離和遺傳分化系數(shù)Tab.3 Average pairwise difference and Fst between five yellow catfish populations

表4 黃顙魚5 個(gè)種群間遺傳差異的分子方差分析表(AMOVA)Tab.4 Analysis of molecular variance (AMOVA)of five populations of yellow catfish

圖1 5 個(gè)黃顙魚地理種群的 UPGMA 聚類樹Fig.1 Dendrogram of five yellow catfish populations by UPGMA method based genetic distance

2.3 聚類分析

將60 個(gè)黃顙魚個(gè)體的mtDNA cyt b序列輸入MEGA 4.1 軟件，對(duì)5 個(gè)湖泊種群進(jìn)行聚類分析，得到UPGMA聚類樹(圖1).5 個(gè)黃顙魚地理種群沒有明顯聚類，形成了單系類群，長(zhǎng)江中游的鄱陽湖與巢湖首先聚為一支，接著分別與下游的滆湖、洪澤湖和太湖聚合，基本與地理分布距離一致.

2.4 種群擴(kuò)張

用Fu’Fs 中性檢驗(yàn)5 個(gè)湖泊黃顙魚種群的顯著偏離中性突變，F(xiàn)u[18]認(rèn)為:Fs ＞0，表明種群趨于穩(wěn)定，F(xiàn)s ＜0，表明種群趨于擴(kuò)張.檢驗(yàn)結(jié)果顯示，種群的整體Fs=-35.277(P ＜0.05)，這表明5 個(gè)黃顙魚種群整體上有擴(kuò)張趨勢(shì).但巢湖、滆湖、鄱陽湖和太湖種群的Fs 值都小于0，而洪澤湖種群Fs 值大于0.用60 個(gè)個(gè)體的mtDNA cyt b 序列構(gòu)建兩兩間的矩陣，進(jìn)行堿基歧點(diǎn)分布分析，個(gè)體間堿基歧點(diǎn)分布曲線見圖2，曲線呈現(xiàn)出明顯的單峰形，兩個(gè)結(jié)果同時(shí)表明長(zhǎng)江中下游5 個(gè)湖泊的黃顙魚在歷史上可能經(jīng)歷了種群擴(kuò)張事件.

3 討論

3.1 遺傳多樣性

圖2 5 個(gè)黃顙魚種群mtDNA cyt b 基因錯(cuò)配堿基分布Fig.2 The mismatch distribution of the Mitochondrial DNA cyt b of five yellow catfish populations

本研究中5 個(gè)湖泊黃顙魚種群 cyt b 序列的堿基組成為 T(26.0%)、C(32.3%)、A(27.6%)、G(14.1%)，其中G 的含量顯著低于其他堿基的含量，表現(xiàn)出明顯的反G 偏倚，顯示出細(xì)胞色素b 基因的共同特征[19]，這也是線粒體 DNA 的一個(gè)特點(diǎn)[20].從魚類線粒體DNA cyt b 基因分析研究的報(bào)道可知，福建近海竹莢魚(Trachurus japonicus)[21]cyt b 基因 A +T 含量為 50.9% 、怒江角魚(Epalzeorhynchus bicornis)[22]A +T 含量為 62.5% ，鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)[23]A+T 含量為 54.4%，鲌亞科魚類(Culterinae)[24]A+T 含量為 56.6% ，本研究中黃顙魚 A+T含量為53.6%，略高于G+C 含量46.4%，符合其他魚類cyt b序列堿基組成的特點(diǎn).

本研究所涉及的5 個(gè)湖泊黃顙魚種群60 個(gè)個(gè)體間的單倍型序列顯示，mtDNA cyt b 基因單倍型序列種類豐富，總數(shù)達(dá)到37 種，占全部序列的61.67%，平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為 0.945 ±0.018 和 0.00419 ±0.00043，高于怒江角魚[22](0.579 ± 0.069、0.00070 ± 0.00012)、黃河裸體裂尻[25](0.700 ± 0.218、0.0026 ± 0.0019)和青海湖裸鯉[26](0.783 ± 0.053、0.00205 ± 0.00126)，與鯉魚[27](0.637 ±0.055、0.00857 ±0.00200)和福建近海竹莢魚[21](0.937 ±0.025、0.336 ±0.034)相比，遺傳多樣性略低.黃顙魚群體的單倍型多樣度高(h=0.945 ±0.018)而核苷酸多樣度低(π=0.00419 ±0.00043).Grant等[28]依據(jù)單倍型多樣度h 和核苷酸多樣度π 推測(cè)了魚類群體的4 種進(jìn)化情景(高h(yuǎn)，高π;高h(yuǎn)，低π;低h，高π;低h，低π)，黃顙魚種群的狀況被認(rèn)為可能是小的有效種群經(jīng)過一段時(shí)間的穩(wěn)定后發(fā)生了擴(kuò)張，快速的種群增長(zhǎng)有利于提高對(duì)新突變的保持力而導(dǎo)致核苷酸多樣度降低.Watanabe 等[8]以mtDNA D-loop 區(qū)為分子標(biāo)記，從采自黑龍江水系至珠江水系的60 個(gè)黃顙魚樣本中獲得8 個(gè)單倍型，不同水系間平均遺傳距離為0.006.丁言偉[11]研究了我國(guó)不同水系60 個(gè)黃顙魚樣本的線粒體ND4 序列，獲得23 個(gè)單倍型，遺傳距離在0.001 ～0.007 之間，核苷酸多樣度π 為0.0025，與本研究中cyt b 基因序列變異的分析結(jié)果高度一致.因此，本研究中黃顙魚種群遺傳多樣性低的原因并不是cyt b 基因進(jìn)化過于保守，更有可能是對(duì)黃顙魚種群遺傳多樣性現(xiàn)狀的真實(shí)反映.

AMOVA 對(duì)遺傳變異的分析表明，全部遺傳變異的93.16%來自種群內(nèi)部，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各種群間的遺傳變異，說明黃顙魚各種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性較高，遺傳變異多來源于種群內(nèi)，只有較少部分存在于種群間.

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

群體遺傳學(xué)認(rèn)為，F(xiàn)st值可以表示群體間的分化程度，一般在0 ～0.05 之間表示分化較弱，0.05 ～0.15 之間表示遺傳分化中等，如達(dá)到0.15 ～0.25 之間表示遺傳分化較大，而超過0.25 表示遺傳分化極大.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5 個(gè)湖泊黃顙魚種群間的遺傳分化系數(shù)Fst為0.0684，說明5 個(gè)黃顙魚種群間存在中等偏低的遺傳分化，不存在顯著的系統(tǒng)地理格局.群體間的相對(duì)遺傳距離能反映群體間的親緣關(guān)系，本研究中種群間的遺傳距離在0.00375 ～0.00651 之間，太湖與滆湖種群間的遺傳距離最遠(yuǎn)，鄱陽湖和巢湖種群之間遺傳距離最近.滆湖與太湖地理位置相對(duì)最近，遺傳距離卻最遠(yuǎn)，這可能與滆湖種群采集的樣本偏少有關(guān).另外，為了治理太湖水質(zhì)，太湖的各個(gè)入湖和出湖的水道上都建立了大量水利設(shè)施，阻斷了滆湖與太湖黃顙魚種群的交流，人為地加大了2 個(gè)湖泊黃顙魚種群間的遺傳分化.根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 進(jìn)化樹顯示5 個(gè)種群沒有分化成不同的分枝譜系，這些結(jié)果表明5 個(gè)湖泊的黃顙魚在cyt b 水平上未出現(xiàn)群體遺傳分化，提示種群間存在廣泛的基因交流.一般認(rèn)為，由于地理隔離造成魚類基因交流的完全中斷，或同一水域中不同棲息環(huán)境的存在部分地限制魚類的基因交流，是物種形成種群結(jié)構(gòu)甚至分化出亞種的重要因素[29].Wright 認(rèn)為:當(dāng)種群基因流系數(shù)Nm ＞1 時(shí)，種群間存在一定的基因流動(dòng):如果Nm ＞4，它們就是一個(gè)隨機(jī)的單位;如果Nm 遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，種群會(huì)被強(qiáng)烈的分化[30].而本實(shí)驗(yàn)中單倍型之間的基因流系數(shù)Nm 為12.30，單倍型遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.01992，60 個(gè)個(gè)體的基因流Nm 為1.61，Gst為0.13441，表明5 個(gè)湖泊種群間存在相當(dāng)大的基因流動(dòng).黃顙魚是一種生態(tài)適應(yīng)性很強(qiáng)的魚類，不同水系的居群借助于水系的連通而發(fā)生基因交流的可能性很大，5 個(gè)湖泊種群的黃顙魚生境差異不明顯，在一定程度上為種群間的基因交流提供了有利條件，這可能是造成長(zhǎng)江中下游湖泊的黃顙魚種群缺乏比較明顯的地理種群，進(jìn)化過程中未形成明顯的種群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素.

黃顙魚是我國(guó)最重要的中小型淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一，廣泛分布于我國(guó)湖泊和河流等水域，種群歷史演化檢測(cè)結(jié)果表明，黃顙魚種群存在擴(kuò)張趨勢(shì).保護(hù)好長(zhǎng)江及其流域內(nèi)各支流和湖泊中魚類的遺傳多樣性是我國(guó)重要的漁業(yè)管理政策.本研究對(duì)黃顙魚mtDNA cyt b 基因的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳變異水平進(jìn)行探討，為黃顙魚的種質(zhì)資源評(píng)估提供了部分基礎(chǔ)資料.本研究表明長(zhǎng)江中下游5 個(gè)湖泊的黃顙魚種群具有中等的遺傳變異，而目前黃顙魚養(yǎng)殖和繁育的親本大多來源于野生資源的捕撈，過度捕撈、生態(tài)環(huán)境的破壞以及人工繁殖數(shù)代退化后的種苗流入自然水域，造成野生資源的進(jìn)一步退化.因此，需要加強(qiáng)對(duì)黃顙魚野生種質(zhì)資源的保護(hù)，有必要建立規(guī)范的良種保種和選育基地，在保證種群自然擴(kuò)張、提高遺傳多樣性的同時(shí)，保護(hù)良種的種質(zhì)資源，維護(hù)良種的純度和遺傳穩(wěn)定性，還能大量供應(yīng)市場(chǎng)，滿足廣大人民群眾的消費(fèi)需求.

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